Diagnosis of beta-globin gene mutations in single blastomere by reverse dot blot hybridization - Jiraporn Pansatha (Chulalongkorn University, 2003)
เหตุผลของการศึกษา เทคนิครีเวอร์สดอทบล็อทไฮบริไดเซชั่นเป็นวิธีที่ใช้ในการวินิจฉัยทารกก่อนคลอด ของโรคเบต้าธาลัสซีเมีย เนื่องจากยีนเบต้ากลอบบินมีชนิดการกลายพันธุ์ที่หลากหลาย ซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากเบสเปลี่ยนแปลงไปเฉพาะจุด การศึกษาวิจัยครั้งนี้คือการนำเทคนิคนี้ มาใช้ในการตรวจตัวอ่อนก่อนการย้ายฝากในโพรงมดลูก ซึ่งเป็นการวินิจฉัยความผิดปกติของยีนเบต้าธาลัสซีเมียในระดับดีเอ็นเอของบลาสโตเมียร์เดี่ยว คุณภาพและปริมาณของผลิตผลจาก พีซีอาร์ เป็นปัจจัยสำคัญของการทำไฮบริไดเซชั่น ของเทคนิครีเวอร์สดอทบล็อทไฮบริไดเซชั่น ปฏิกริยาพีซีอาร์จะถูกปรับเปลี่ยนให้เหมาะสม เพื่อเพิ่มปริมาณยีนเบต้ากลอบบินให้เพียงพอ สำหรับการตรวจกรองความผิดปกติของยีนเบต้า กลอบบิน โดยวิธีรีเวอร์สดอทบล็อทไฮบริไดเซชั่นต่อไป วิธีการ การวิจัยมุ่งประเด็นที่จะแก้ปัญหาการหาสภาวะที่เหมาะสมในการเพิ่มปริมาณยีนเบต้ากลอบบินของเซลล์เดี่ยวตัวอ่อนโดยใช้การทำพีซีอาร์ 2 ขั้นตอน เริ่มต้นจากการหาความเข้มข้นของดีเอ็นเอจากเลือดที่ต่ำที่สุดที่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นได้ จากนั้นทำการเพิ่มปริมาณยีนเบต้ากลอบบินของบลาสโตเมียร์เดี่ยวจำนวน 106 เซลล์ การหาอุณหภูมิแอลนีลลิ่งที่เหมาะสม การศึกษาผลของไพรเมอร์คู่ในต่อการทำพีซีอาร์ และศึกษาเปรียบเทียบวิธีไลสีสเซลล์ ใช้บลาสโตเมียร์เดี่ยว 25 50 และ 256 เซลล์ ตามลำดับ ขั้นตอนสุดท้าย วินิจฉัยการกลายพันธุ์ของยีนเบต้ากลอบบิน ของดีเอ็นเอจากเลือดและและบลาสโตเมียร์เดี่ยวที่เพิ่มปริมาณเอ็นเอแล้ว ผลการศึกษา เมื่อเพิ่มปริมาณ ดีเอ็นเอจากเลือดที่ลดความเข้มข้นเป็นลำดับ สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของเลือดลดความเข้มข้นจนถึงระดับต่ำสุดที่ 12.5 พิโครกรัม เมื่อเพิ่มปริมาณยีนเบต้ากลอบบินของบลาสโตเมียร์เดี่ยว มีอัตราความสำเร็จเท่ากับร้อยละ 26.4 ซึ่งค่อนข้างต่ำ จึงทำการปรับองค์ประกอบของการทำพีซีอาร์ เริ่มจากการปรับอุณหภูมิแอลนีลลิ่ง พบว่าที่อุณหภูมิ 58 องศาเซนเซียส สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้สำเร็จ ศึกษาผลของไพรเมอร์ต่อการทำพีซีอาร์ จึงทำการเปลี่ยนเนสเต็ดไพรเมอร์ อัตราความสำเร็จในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเพียงร้อยละ 22 เมื่อเปลี่ยนไพรเมอร์คู่นอกและปรับสภาวะในการทำพีซีอาร์ อีกครั้ง พร้อมกับการไตเตรดความเข้มข้นของไพรเมอร์ พบว่าความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่เหมาะสมคือ 0.1 ไมโครโมลาร์ จึงใช้สภาวะที่เหมาะสมนี้ในการศึกษาเปรียบเทียบวิธีไลสีสเซลล์ พบว่าไม่มีความแตกต่างระหว่างวิธีที่ใช้น้ำ (ต้มที่ 94 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที) กับวิธีที่ใช้ทีอีบัฟเฟอร์ (ต้มที่ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที) ซึ่งให้อัตราความสำเร็จในการเพิ่มปริมาณยีน เบต้ากลอบบินของเซลล์เดี่ยวตัวอ่อนเท่ากับ ร้อยละ 58 และ 55.4 ตามลำดับ ต่างจากการใช้อัลคาไลน์ บัฟเฟอร์ ซึ่งให้อัตราความสำเร็จในการเพิ่มปริมาณยีนเบต้ากลอบบินของเซลล์เดี่ยวตัวอ่อนร้อยละ 0 ในการทดลองสุดท้าย นำดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณแล้วจากดีเอ็นเอ 10 พิโครกรัม ที่ทราบตำแหน่งการกลายพันธุ์ของยีนเบต้ากลอบบินแล้วมาตรวจสอบตำแหน่งการกลายพันธุ์อีกครั้ง เพื่อตรวจสอบความถูกต้องและแม่นยำของวิธีเรีเวอร์สดอทบล็อทไฮบริไดเซชั่น พบว่าตำแหน่งการกลายพันธุ์ทุกตำแหน่งถูกต้องตรงกับผลการตรวจเดิม บลาสโตเมียร์เดี่ยวที่เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอแล้วประสบผลสำเร็จในการทำไฮบริไดเซชั่นเช่นกัน สรุป การศึกษาครั้งนี้ ประสิทธิภาพของการเพิ่มขยายดีเอ็นเอจำเพาะในเซลล์เดี่ยวตัวอ่อนด้วยเทคนิคพีซีอาร์ 2 ขั้นตอน ยังมีประสิทธิภาพค่อนข้างต่ำ จึงยังไม่สมควรที่จะนำวิธีรีเวอร์สดอทบล็อทไฮบริไดเซชั่น มาใช้ในการวินิจฉัยความผิดปกติของยีนเบต้ากลอบบิน ในตัวอ่อนของคน ก่อนที่จะได้นำไปฝังตัวในมดลูกได้