Overexpression of cellulolytic enzymes in Pichia pastoris and its applications in ethanol fermentation of rice straw - Nassapat Boonvitthya (Chulalongkorn University, 2011)
ในปัจจุบันนี้ความสำคัญของอุตสาหกรรมการกลั่นชีวภาพจากมวลชีวภาพที่มีศักยภาพทางเศรษฐกิจกำลังได้รับความสนใจเพิ่มขึ้นและกลายเป็นงานวิจัยที่มีความความสำคัญสูง อย่างไรก็ตามสิ่งมีชีวิตที่มีความสามารถในการย่อยสลายมวลชีวภาพผลิตเอนไซม์หลากหลายชนิดซึ่งยากต่อการทำให้บริสุทธิ์ และประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมการกลั่นชีวภาพ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อคำนึงถึงค่าอุณหภูมิและพีเอชที่ทำให้ค่าแอคทิวิตีของเอนไซม์สูงสุด ดังนั้นยังคงมีความจำเป็นในการผลิตเอนไซม์เซลลูเลสจากเชื้อราในสิ่งมีชีวิตชนิดอื่นที่มีความสามารถในการผลิตเอนไซม์ได้มาก โดยที่สามารถถ่ายโอนยีนและทำให้เอนไซม์บริสุทธิ์ได้ง่ายเพื่อที่จะมอบความสามารถในการสลายเซลลูโลสให้กับจุลินทรีย์ที่ไม่มีความสามารถนี้ และพัฒนาตัวเร่งปฏิกิริยาให้มีลักษณะบางอย่างดีกว่าตัวเร่งปฏิกิริยาแบบดั้งเดิมโดยผ่านการออกแบบอย่างมีเหตุผลหรือผ่านวิวัฒนาการแบบตรง ในวิทยานิพนธ์นี้ ยีนกลูแคนเบต้ากลูโคซิเดสจากเชื้อรา Aspergillus oryzae ประสบความสำเร็จในการแสดงออกภายใต้การควบคุมของโพรโมเตอร์ที่มีการแสดงออกแบบตลอดเวลาหรือแบบเหนี่ยวนำในยีสต์ Pichia pastoris เอนไซม์ที่ผลิตได้มีขนาดมวลโมเลกุลประมาณ 40 กิโลดาลตัน โดยมีความเหมือนของลำดับกรดอะมิโนกับฐานข้อมูล 96 เปอร์เซ็นต์ เอนไซม์ที่ผลิตได้มีค่าแอคทิวิตีสูงสุดที่ 2 ยูนิตต่อมิลลิลิตร ที่เวลา 42 ชั่วโมง ภายใต้การควบคุมแบบเหนี่ยวนำและมีความสามารถทนกลูโคสได้ที่ความเข้มข้น 365 มิลลิโมลาร์ ค่าคงที่ของมิคาลิส 0.56 มิลลิโมลาร์ และอัตราเร็วสูงสุด 10042 ไมโครโมลาร์ต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน นอกจากนี้ลำดับการเข้ารหัสของยีนเอนโดกลูคาเนส 2 และเซลโลไบโอไฮโดรเลส 2 จากเชื้อรา Trichoderma reesei สายพันธุ์ QM9414 ยังประสบความสำเร็จในการถูกโคลนเข้าสู่ยีสต์ Yarrowia lipolytica และทำการเปรียบเทียบระดับการแสดงออกกับยีสต์ P. pastoris เพื่อชี้ให้เห็นความเป็นไปได้ที่จะใช้ Y. lipolytica เป็นยีสต์ทางเลือกในการผลิตเอนไซม์ย่อยสลายเซลลูโลส ค่าแอคทิวิตีของเอนไซม์เอนโดกลูคาเนสและเซลโลไบโอไฮโดรเลสถูกทำให้สูงสุดในยีสต์ Y. lipolytica สายพันธุ์ Po1d โดยใช้โพรโมเตอร์ที่มีการแสดงออกแบบตลอดเวลาและใช้สัญญาณการหลั่งของยีน preproLip2 แอคทิวิตีของเอนไซม์เอนโดกลูคาเนสที่ได้จาก Y. lipolytica มีค่าน้อยกว่าที่ได้จาก P. pastoris ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วยเอทานอลความเข้มข้น 3 เปอร์เซ็นต์ ประมาณ 7 เท่า ในขณะที่ระดับการแสดงออกของเอนไซม์เซลโลไบโอไฮโดรเลสที่ได้จาก Y. lipolytica และค่าแอคทิวิตีจำเพาะมีค่ามากกว่าที่ได้จาก P. pastoris ระดับของการเปลี่ยนแปลงของเอนไซม์ผ่านกระบวนการไกลโคซิเลชั่นมีผลเพียงเล็กน้อยต่อระดับการแสดงออกและคุณสมบัติของเอนไซม์ ภายหลังการทำวิวัฒนาการแบบตรงโดยใช้วิธีปฎิกิริยาลูกโซ่แบบสุ่ม และการทำให้เกิดการกลายแบบอิ่มตัวบริเวณจำเพาะ พบว่ากรดอะมิโนของยีนเอนโดกลูคาเนส 2 ที่ตำแหน่ง 257 ได้เปลี่ยนแปลงจากกรดอะมิโนทรีโอนีนเป็นกรดอะมิโนแอสปาเตตหรือแอสปาราจีน ซึ่งสามารถปรับปรุงคุณสมบัติการทนร้อนของเอนไซม์นี้ จากที่สามารถทนร้อนได้ที่อุณหภูมิ 70 องศาเซลเซียส เวลา 60 นาที เป็น 120 นาที ผลการทดลองนี้ชี้ให้เห็นว่า Y. lipolytica เป็นระบบที่มีศักยภาพและน่าสนใจสำหรับการแสดงออกของเอนไซม์และการคัดเลือกสายพันธุ์กลายอย่างมีประสิทธิภาพ