Gene cloning, expression and characterization of lipase from Fusarium Solani for the production of biodiesel - Weerasak Thakernkarnkit (Chulalongkorn University, 2010)
ไบโอดีเซลเป็นผลิตภัณฑ์ที่เกิดจากไตรกลีเซอไรด์ในปฏิกิริยาทรานส์เอสเทอริฟิเคชั่นที่มีกรดหรือเบสเป็นตัวเร่ง อย่างไรก็ตาม ตัวเร่งปฏิกิริยาทางชีวภาพเช่นไลเพสได้รับความสนใจมากขึ้น ด้วยเหตุนี้จึงมีการคัดเลือกไลเพสจากจุลินทรีย์ในธรรมชาติเพื่อนำมาใช้ในการผลิตไบโอดีเซลด้วยปฏิกิริยาดังกล่าว โดยนำพันธุวิศวกรรมมาใช้พัฒนาและเพิ่มปริมาณการผลิตไลเพส งานวิจัยนี้ทำการโคลนยีน ไลเพสที่ผลิตได้จาก เชื้ัอรา Fusarium solani เข้าสู่ pPICZαA พบว่ายีนที่ได้มีขนาด 1002 คู่เบส และแปลรหัสเป็นกรดอะมิโนได้ 333 หน่วย จากนั้นถ่ายโอนยีนไลเพสดังกล่าวเพื่อแสดงออกใน Pichia pastoris สายพันธุ์ KM71 พบว่า ภาวะที่เหมาะสมในการเหนี่ยวนำการแสดงออกได้แก่การบ่มใน เมทานอลปริมาณ 3% ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เวลา 5 วัน จากนั้นทำรีคอมบิแนนท์ไลเพสที่ได้ให้บริสุทธิ์เพื่อศึกษาลักษณะสมบัติ พบว่าเอนไซม์มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 2.5 เท่า และมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 40 กิโลดาลตัน จากการศึกษาความจำเพาะของสารตั้งต้น พบว่า เอนไซม์มีความจำเพาะต่อสาร ตั้งต้นที่มีจำนวนคาร์บอนตั้งแต่ 4 ถึง 14 อะตอม ภาวะที่เหมาะสมของการทํางานคือความเป็นกรดด่างเท่ากับ 9 ช่วงอุณหภูมิ 35-40 องศาเซลเซียส อีกทั้งมีความเสถียรที่ความเป็นกรดด่าง 5.0 ถึง 10.0 ที่อุณหภูมิต่ำกว่า 35 องศาเซลเซียส เมื่อศึกษาสารที่มีผลต่อการทํางานของเอนไซม์ พบว่า ไอออนของโลหะ ตัวทำละลายที่ไม่มีขั้วและสารลดแรงตึงผิวส่วนใหญ่ไม่มีผลต่อค่าการทำงานของรีคอมบิแนนท์ไลเพส แต่ถูกยับยั้งอย่างรุนแรงด้วย SDS และสารรีดิวซิ่ง β- mercaptoethanol เมื่อนํารีคอมบิแนนท์ไลเพสมาเร่งปฏิกิริยาไฮดรอลิซิสของน้ำมันพืช 7 ชนิด ได้แก่ มะพร้าว เงาะ ปาล์ม มะละกอ มะกอก สบู่ดำ และดอกคำฝอย พบว่าน้ำมันมะพร้าวเป็นสารตั้งต้นที่ให้ค่าการทํางานจำเพาะสูงสุดเท่ากับ 1.14 ไมโครโมลต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน จากนั้นศึกษาการเร่งปฏิกิริยาทรานส์เอสเทอริฟิเคชั่นของเอนไซม์ โดยใช้น้ำมันที่ให้ค่าการทำงานจำเพาะสูงจากปฏิกิริยาไฮดรอลิซิส 4 ชนิด ได้แก่มะพร้าว เงาะ มะละกอ และปาล์ม เป็นสารตั้งต้น พบว่าน้ำมันที่สกัดจากเงาะสามารถผลิตไบโอดีเซลได้ประมาณ 45 เปอร์เซ็นต์ซึ่งสูงกว่ามะละกอ ปาล์ม และมะพร้าว ตามลําดับ จากผลการศึกษาทั้งหมดสรุปได้ว่าสามารถโคลนยีนไลเพสจากเชื้อรา Fusarium solani ซึ่งมีความสามารถแสดงออกในการเร่งปฏิกิริยาไฮดรอลิซิสและทรานส์เอสเทอริฟิเคชั่นสําหรับการผลิตไบโอดีเซลได้