Genetic diversity and population structure of the blue swimming crab Portunus pelagicus in Thailand - Natechanok Thamniemdee (Chulalongkorn University, 2007)
วิเคราะห์ความหลากหลายทางพันธุกรรมและโครงสร้างประชากรของปูม้า (Portunus pelagicus)ในประเทศไทยด้วยเทคนิค SSCP โดยนำไพร์เมอร์จำนวน 38 คู่มาทำปฎิกิริยาพีซีอาร์กับดีเอ็นเอของปูม้า (N = 3) พบว่า cytochrome oxidase subunit I (COI), M122/135RAP และ P[subscript +3]4M[subscript +3]1_454 ให้แถบดีเอ็นเอที่ชัดเจน จึงทำการโคลนและหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ที่ได้และออกแบบไพร์เมอร์ที่จำเพาะกับลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้นดีเอ็นเอดังกล่าว (PP-COI[subscript 270]-F/R, PP-SCARRAP[subscript 318]-F/R และ PP-SCARAFLP[subscript 300]-F/R ตามลำดับ) ทำการทดสอบกับตัวอย่างปูม้าจากจันทบุรี (N = 29) ประจวบคีรีขันธ์ (N = 40) สุราษฎร์ธานี (N = 35) ระนอง (N = 35) และกระบี่ (N = 35) จำนวนรวมทั้งสิ้น 174 ตัว ด้วยเทคนิค single strand conformational polymorphism (SSCP) พบแถบดีเอ็นเอจำนวน 9, 19 และ 7 แถบ และพบรูปแบบ SSCP ทั้งหมดจำนวน 8, 56 และ 21 รูปแบบจาก PP-COI[subscript 270], PP-SCARRAP[subscript 318] และ PP-SCARAFLP[subscript 300] ตามลำดับ จากจำนวนรูปแบบของ SSCP ที่พบบ่งชี้ได้ว่าปูม้าในประเทศไทยมีความหลากหลายทางพันธุกรรมภายในชนิดสูง โดยพบค่าเฉลี่ยความเหมือนทางพันธุกรรมระหว่างกลุ่มตัวอย่างเท่ากับ 0.8871 - 0.9902 และพบความแตกต่างทางพันธุกรรมระหว่างกลุ่มตัวอย่างเท่ากับ 0.0099 - 0.1198 ซึ่งความแตกต่างของกลุ่มตัวอย่างระหว่างฝั่งทะเล (0.0346 - 0.1198) มีมากกว่ากลุ่มตัวอย่างที่อยู่ฝั่งทะเลเดียวกัน (0.0099 – 0.0198 และ 0.0135) และพบการแบ่งแยกทางพันธุกรรมของตัวอย่างปูม้าที่ทำการศึกษาอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P < 0.0001) แสดงว่าของปูม้าในประเทศไทยจากแหล่งต่างๆไม่ได้มียีนพูลเดียวกัน แต่มีการแบ่งแยกเป็นหลายกลุ่มประชากรพันธุศาสตร์ ทั้งนี้สามารถคิดค่ายีนโฟลของปูม้าในประเทศไทยได้เท่ากับ 0.39 - 5.37 ตัวต่อรุ่น เมื่อนำค่าระยะห่างทางพันธุกรรมของแต่ละคู่กลุ่มตัวอย่างไปสร้างแผนภูมิ UPGMA พบว่าสามารถแยกตัวอย่างที่ศึกษาออกได้เป็น 2 กลุ่มวิวัฒนาการตามฝั่งทะเลของประเทศไทย คือ จันทบุรี สุราษฎร์ธานี และ ประจวบคีรีขันธ์ (ฝั่งทะเลอ่าวไทย กลุ่ม A) กับ ระนองและกระบี่ (ฝั่งทะเลอันดามัน กลุ่ม B) นอกจากนี้ได้ทำการพัฒนาเครื่องหมายพันธุกรรมที่จำเพาะกับปูม้าชนิด P. pelagicus โดยโคลนและหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ซึ่งมีขนาด 706 คู่เบส และ 12S rDNA ซึ่งมีขนาด 406 คู่เบส ทำการออกแบบไพร์เมอร์จากลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้และทดสอบความจำเพาะของไพรเมอร์ที่พัฒนา (PP-COI[subscript 270]-F/R สำหรับ COI และ PP-12S[subscript 312]-F/R สำหรับ 12S rDNA) กับ genomic DNA ของปูครอบครัว Portunidae ชนิดต่างๆ โดยเครื่องหมาย PP-COI[subscript 270] นั้นให้ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ขนาด 270 คู่เบส เฉพาะในปูม้า P. pelagicus (N = 174) แต่ไม่ให้ผลิตภัณฑ์ดังกล่าวในปูทะเล (Scylla oceanica, N = 18, S. serrata, N = 7, S. tranquebarica, N= 9) ปูลาย Charybdis crucifera (N = 20) และปูดาว P. sanguinolentus (N = 10) สำหรับเครื่องหมาย PP-12S[subscript 312] นั้นให้ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ขนาด 312 คู่เบส ในทุกตัวอย่างของปูม้า P. pelagicus (N = 174) และทุกตัวอย่างของปูชนิดอื่นๆ จึงนำผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ของปูชนิดต่างๆ มาวิเคราะห์ความแตกต่างของลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วยเทคนิค SSCP พบรูปแบบ SSCP จำนวน 5 แบบในปูม้า (N = 174) โดยรูปแบบที่พบมากที่สุดคิดเป็น 91.4% (159/174) ของตัวอย่างที่ศึกษา โดยรูปแบบ SSCP ของปูม้าแตกต่างไปจากรูปแบบที่พบในปูทะเล ปูลาย และปูดาว เครื่องหมายโมเลกุลที่พัฒนาได้สามารถนำไปตรวจสอบและยืนยันผลิตภัณฑ์ของปูม้าจากประเทศไทย นอกจากนี้ได้ทำการสืบค้นยีนที่มีการตอบสนองต่ออุณหภูมิในเลือดของปูม้า P. pelagicus ด้วยเทคนิค cDNA-AFLP โดยทำการคัดเลือกไพร์เมอร์ทั้งสิ้น 110 คู่ และใช้ cDNA ที่สกัดจากเลือดปูม้าเป็นต้นแบบ โดยศึกษาเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มควบคุม (N = 4) กับกลุ่มทดลองที่มีการกระตุ้นโดยอุณหภูมิที่ 33 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 ชั่งโมงและทำการเก็บเลือดหลังถูกกระตุ้นไปแล้วเป็นเวลา 0, 3, 6, 12 และ 24 ชั่วโมงตามลำดับ (N = 4 ในแต่ละกลุ่มตัวอย่าง) ได้เลือกชิ้น cDNA-AFLP ที่มีการตอบสนองต่ออุณหภูมิจำนวนทั้งหมด 7 ชิ้นไปโคลนและหาลำดับนิวคลีโอไทด์ จากนั้นออกแบบไพร์เมอร์ที่จำเพาะ และศึกษาระดับการแสดงออกของยีน PP-TSRT[subscript 152], PP-TSRT[subscript 200]และ PP-TSRT[subscript 339] ด้วยวิธี semiquantitative RT-PCR พบว่า PP-TSRT[subscript 152] และ PP-TSRT[subscript 339] มีการแสดงออกลดลงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ 12 และ 24 ชั่วโมง และ 12 ชั่วโมง หลังการกระตุ้นด้วยอุณหภูมิตามลำดับ (P < 0.05)