Structural analysis of cyclodextrin glycosyltransferase isoforms from Paenibacillus sp. A11 - Wanida Prasong (Chulalongkorn University, 2002)
งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์ในการศึกษาลักษณะโครงสร้างของไซโคลเดกซ์ทรินไกลโค ซิลทรานสเฟอเรส (CGTase) ไอโซฟอร์มจาก Paenibacillus sp. A11 เพื่อนำข้อมูลมาประกอบการวิเคราะห์การเกิดหลายรูปแบบของเอนไซม์ เมื่อทำการแยกไอโซฟอร์มทั้ง 4 ของ CGTase จาก Paenibacillus sp. A11 ด้วยเทคนิค preparative gel electrophoresis แล้วศึกษาผลของ post-translational modification ได้แก่ ไกลโคซิเลชัน ฟอสโฟริเลชัน การสร้างพันธะไดซัลไฟด์ และการดัดแปรหมู่คาร์บอกซิลิก พบว่าเมื่อทำปฏิกิริยา deglycosylation ด้วยเอนไซม์ PNGase F และ Endo H และด้วยสารเคมี trifluoromethanesulfonic acid (TFMS) สรุปได้ว่า deglycosylation ไม่มีผลต่อขนาดและประจุสุทธิของทุกไอโซฟอร์ม แต่มีผลต่อแอคติวิตีของไอโซฟอร์ม 3 และ 4 และเมื่อทำปฏิกิริยา dephosphorylation ด้วยเอนไซม์ alkaline phosphatase และตรวจสอบการเกิดพันธะไดซัลไฟด์โดยการใช้สารรีดิวซิ่ง พบว่า ทั้งสองกลไกไม่มีผลต่อการเกิดหลายรูปแบบของเอนไซม์ จากการเปลี่ยนแปลงหมู่โซ่ข้างกรดอะมิโนที่เป็นหมู่คาร์บอกซิลิกด้วยสาร เปลี่ยนแปลงกลุ่มจำเพาะชนิด 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ได้ผลซึ่งคาดว่ากลไก amidation/deamidation มีผลต่อการเปลี่ยนประจุสุทธิในโครงสร้างของทุกไอโซฟอร์ม ในผลการทดลองส่วนที่สอง ทำการทดลองเพื่อวิเคราะห์ว่าหลายรูปแบบของ CGTase เป็นโปรตีนเดียวกันหรือไม่ เมื่อวิเคราะห์เพปไทด์ที่เกิดจาก การย่อยด้วยเอนไซม์ทริปซินโดยคอลัมน์ HPLC (C18) แบบ reverse phase ได้ผลว่า จำนวนและชนิดของเพปไทด์ของทุกไอโซฟอร์มไม่มีความแตกต่างกัน แล้วตรวจสอบกรดอะมิโนที่เป็นองค์ประกอบพบว่า องค์ประกอบกรดอะมิโนของทุก ไอโซฟอร์มไม่แตกต่างกันอย่างชัดเจน ในการตรวจสอบองค์ประกอบโปรตีนโดยคอลัมน์ HPLC (C4) แบบ reverse phase พบว่า ทุกไอโซฟอร์มประกอบด้วยพีคหลัก 2 พีคเหมือนกัน คือที่ Rt 10.924-10.954 และ 11.951-11.595 นาที เมื่อวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนที่ปลาย N ของทุกไอโซฟอร์ม พบว่า มีลำดับกรดอะมิโน 5 ตัวแรก (APDTS) เหมือนกับเอนไซม์ในรูป unfractionate ผลจากการวิเคราะห์พอลิอะคริลาไมด์เจลอิเลคโทรโฟริซิสสองไดเมนชัน สนับสนุนว่า ทุกไอโซฟอร์มเกิดจากโปรตีนเดียวกัน นอกจากนี้ในการเปรียบเทียบ CGTase ที่ผลิตจาก E.coli ที่ได้รับยีน CGTase จากสายพันธุ์ Paenibacillus sp. A11 กับเอนไซม์ของสายพันธุ์เดิม พบว่ามีรูปแบบการเกิดหลายไอโซฟอร์มเหมือนกัน จากข้อมูลทั้งหมดอาจสรุปได้ว่า หลายรูปแบบของ CGTase เกิดจาก โปรตีนชนิดเดียวที่มีการเปลี่ยนแปลงหลังการถอดรหัสและแปรรหัสจากยีน เมื่อศึกษาจลนพลศาสตร์ของไอโซฟอร์ม 1 พบว่า alpha-CD เป็นสับสเตรทที่ดีที่สุดในปฏิกิริยา coupling reaction (kcat/Km 3368 +- 300 mM-1.min-1) และ maltohexaose เป็นสับสเตรทที่ดีที่สุดในปฏิกิริยา cyclization reaction (kcat/Km 107 +- 5 mM-1.min-1)