Identification of thermotolerant bacteria producing cyclodextrin glycosyltransferase and enzyme characterization - Pornthida Yampayont (Chulalongkorn University, 2002)
จากการคัดเลือกแบคทีเรียทนร้อนที่ผลิตไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรส (CGTase) จากแหล่งดิน น้ำ และของเสียจำพวกแป้งในโรงงานแป้งรวมทั้งตัวอย่างที่มีการปนเปื้อนของคาร์โบไฮเดรตซึ่งเก็บจากบริเวณต่างๆ ในประเทศไทย ในระดับปฐมภูมิพบแบคทีเรียจำนวน 97 โคโลนีที่ทำให้เกิดวงใสบนอาหารแข็ง Medium I ซึ่งมีแป้งเป็นส่วนประกอบเมื่อตรวจด้วย 0.02% I[subscript 2] ใน 0.2%KI ในจำนวนนี้พบว่ามี 3 ไอโซเลท (BT01, BD01 และ BO01) ที่ผลิตไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสโดยทำให้เกิดวงใสสีเหลืองบนพื้นแดงบนอาหารแข็ง Horikoshi ซึ่งประกอบด้วยฟีนอฟทาลีน นำไอโซเลทเหล่านี้ไปเลี้ยงในอาหารเหลว Horikoshi เพื่อศึกษาการเจริญและการผลิตเอนไซม์ที่อุณหภูมิช่วง 37-50 องศาเซลเซียสและเลือกสายพันธุ์ที่มีลักษณะทนร้อนที่ดีที่สุด พบว่า BT01 เจริญและผลิตเอนไซม์ได้ดีในช่วง 37-45 องศาเซลเซียสและเป็นสายพันธุ์ที่ผลิตไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสได้ดีที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับ BD01 และ BO01 ดังนั้นจึงเลือก BT01 ในการศึกษาหาภาวะที่เหมาะสมต่อไป จากการจำแนกสายพันธุ์ตามลักษณะทางชีวเคมีและสรีระวิทยาพบว่า BT01 คือ Bacillus circulans และจำแนกสายพันธุ์ด้วยวิธี 16S rRNA gene พบว่าเป็น Paenibacillus sp. โดยมีความคล้าย 98% BT01 เจริญและผลิตเอนไซม์ได้ดีที่อุณหภูมิ 37-45 องศาเซลเซียส pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเลี้ยงเชื้อเพื่อใช้เป็นเชื้อตั้งต้นคือ pH 9.0 และ 37 องศาเซลเซียสในอาหารเหลว Medium I สภาวะที่เหมะสมในการผลิตเอนไซม์คือเลี้ยงในอาหาร Horikoshi ที่เติม soluble starch 0.5% pH ของอาหารเท่ากับ 9.0 เลี้ยงที่ 40 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 72 ชั่วโมง การทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์บางส่วนด้วยวิธีดูดซับด้วยแป้งได้เอนไซม์คงเหลือ 65% และความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 28 เท่า หาน้ำหนักโมเลกุลโดยวิธี SDS-PAGE มีค่าประมาณ 79 กิโลดาลตัน อุณหภูมิที่เหมาะสมในการวัด dextrinizing activity และ CD-forming activity คือ 70 และ 55 องศาเซลเซียสตามลำดับ ซึ่งทั้งอุณหภูมิ 55 และ 70 องศาเซลเซียสมี pH ที่เหมาะสมในการวัด dextrinizing activity และ CD-forming activity คือ pH 6.0 และ 7.0 ตามลำดับ วัด dextrinizing activity พบว่าเอนไซม์มีความเสถียรที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสและ pH 6.0-9.0 แต่เมื่อวัด CD-forming activity พบว่าเอนไซม์มีความเสถียรที่ 70 องศาเซลเซียสและ pH 6.0-8.0 เมื่อบ่มเอนไซม์ไว้ 1 ชั่วโมง การเติม CaCl[subscript 2] และ soluble starch มีผลต่อความเสถียรของเอนไซม์เล็กน้อย ผลิตภัณฑ์ไซโคลเดกซ์ทรินที่ได้มีอัตราส่วน alpha : beta-CD เท่ากับ 1:1 จากการศึกษาพบว่า pH และอุณหภูมิมีผลต่อการผลิตไซโคลเดกซ์ทริน และอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการผลิตไซโคลเดกซ์ทริน คือ 55-60 องศาเซลเซียส พบว่าชนิดของแป้งไม่มีผลต่อการผลิตไซโคลเดกซ์ทรินซึ่งมีอัตราส่วนระหว่าง alpha : beta-CD คงที่