Development of DNA typing kit in black tiger prawn Penaeus monodon fabricius by microsatellite technique - Pitak Soot-anan (Chulalongkorn University, 1999)
คัดเลือกไมโครแซเทลไลต์จำนวน 8 ตำแหน่ง ได้แก่ CSCUPmol, CSCUPmo2, CSCUPmo3, CSCUPmo4, CSCUPmo6, CSCUPmo7, CSCUPmo9 และ CSCUPmo11 เพื่อใช้ในการจำแนกพันธุกรรมกุ้งกุลาดำ โดยศึกษาความหลากหลายในกลุ่มประชากรกุ้งจากจังหวัดตราดประมาณ 50 ตัว พบจำนวนอัลลีลของแต่ละตำแหน่งเท่ากับ 29, 27, 27, 21, 29, 22, 23 และ 10 อัลลีล ตามลำดับ ได้ค่าเฮเทอโรไซโกซิตี (heterozygosity) ในช่วง 0.21 ถึง 0.90 และให้ขนาดของอัลลีลตั้งแต่ 132 ถึง 380 คู่เบส คัดเลือกเฉพาะเครื่องหมายไมโครแซเทลไลต์ 6 ตำแหน่ง ที่ให้ผลความหลากหลายสูง และให้แถบดีเอ็นเอที่ชัดเจน เพื่อนำมาใช้ในการตรวจสอบยีโนไทป์ยกเว้นไมโครแซเทลไลต์ที่ตำแหน่ง CSCUPmo3 กับ CSCUPmo7 ที่อ่านผลยาก และให้ยีโนโทป์แบบโฮโมไซกัส (homozygous) มากผิดปกติ ชุดจำแนกพันธุกรรมของกุ้งกุลาดำโดยเทคนิคไมโครแซเทลไลต์ ที่ได้รับการพัฒนา ต้องการตัวอย่างเนื้อเยื่อ หรือ เลือดในเอทานอลเพียง 10 มิลลิกรัม หรือ 5 ไมโครลิตร ตามลำดับ สำหรับการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธีอัลคาไลน์ การพัฒนาวิธีการวิเคราะห์ไมโครแซเทลไลต์แบบมัลติเพลกซ์ (multiplex) ช่วยให้สามารถตรวจสอบยีโนไทป์ของกุ้งได้พร้อมกันทีละหลายตำแหน่ง ซึ่งพบว่าไมโครแซเทลไลต์ที่ตำแหน่ง CSCUPmo1 และ CSCUPmo2 สามารถทำมัลติเพลกซ์พีซีอาร์ได้ ส่วนคู่ไมโครแซเทลไลต์ที่ตำแหน่ง CSCUPmo4 และ CSCUPmo9 กับคู่ไมโครแซเทลไลต์ที่ตำแหน่ง CSCUPmo6 และ CSCUPmo11 มีขนาดของผลิตผลพีซีอาร์ที่ไม่ซ้อนกัน สามารถนำมาวิเคราะห์โดยหยอดตัวอย่างพร้อมกันได้ นอกจากนี้สามารถตรวจสอบขนาดของไมโครแซเทลไลต์อัลลีลโดยไม่ใช้สารรังสี โดยนำผลิตผลพีซีอาร์ที่ได้มาแยกขนาดด้วย 8% denaturing polyacrylamide sequencing gel และนำมาย้อมด้วยซิลเวอร์ (silver staining) ส่วนไมโครแซเทลไลต์ที่มีขนาดของอัลลีลต่างกันตั้งแต่ 3 เบส ขึ้นไป ได้แก่ ไมโครแซเทลไลต์ที่ตำแหน่ง CSCUPmo11 สามารถแยกความแตกต่างของอัลลีลโดยใช้ 15% denaturing polyacrylamide minigel ซึ่งสะดวกและรวดเร็วกว่าการใช้ sequencing gel และสามารถสร้างดีเอ็นเอมาตรฐาน สำหรับจำแนกขนาดของอัลลีลที่ตำแหน่ง CSCUPmo11 ได้ ซึ่งช่วยให้การอ่านยีโนไทป์ง่ายและถูกต้องมากยิ่งขึ้น