Detection of cyclodextrin glycosyltransferase gene by synthetic oligonucleotide probes - Surasak Laloknam (Chulalongkorn University, 1997)
ไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจากเชื้อ Bacillus sp. All ผ่านการทำให้บริสุทธิ์โดยการดูดซับด้วยแป้ง ตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตที่ความเข้มข้นอิ่มตัว 40-80 เปอร์เซ็นต์ และโครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์ ดีอีเออี-เซลลูโลส มีแอคติวิตีจำเพาะ 5,000 ยูนิต/มิลลิกรัม โปรตีน มีความบริสุทธิ์ 44.8 เท่า และให้ผลผลิต 30 เปอร์เซ็นต์ เมื่อทำการตรวจสอบความบริสุทธิ์และแอคติวิตีของเอนไซม์ด้วยพอลีอะครีละไมล์เจลอิเลคโตรโฟรีซีสแบบไม่เสียสภาพ พบว่า เอนไซม์บริสุทธิ์ให้แถบโปรตีนตรงกับแถบอะไมโลไลติกแอคติวิตี และ CD-forming แอคติวิตี 2 แถบ คือ แถบเข้มและแถบจาง และพบโปรตีนแถบสำคัญแถบเดียวในระบบเจลที่มีโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต เมื่อนำเอนไซม์บริสุทธิ์ไปหาองค์ประกอบของกรดอะมิโนพบว่ามีกรดอะมิโนประเภทโพลาร์ประมาณ 60 โมลเปอร์เซ็นต์ ซึ่งเป็นกรดอะมิโนชนิด acidic อันได้แก่ กรดแอสพาติก แอสพาราจีน กรดกลูตามิก และกลูตามีน ในปริมาณสูง (ประมาณ 25 โมลเปอร์เซ็นต์) จากนั้นได้หาลำดับกรดอะมิโนที่ด้านปลายอะมิโน 20 ตัวแรก พบว่าเป็น ala, pro, asp, thr, ser, asn, tyr, asn, lys, glu, asn, phe, arg, tyr, asp, val, ile, gln, และ ile ตามลำดับ การออกแบบโอลิโกนิวคลีโอไทด์ขนาด 17 เบส 2 สาย จากการเปลี่ยนรหัสลำดับกรดอะมิโนทางด้านปลายอะมิโนที่หาได้ส่วนทางด้านปลายคาร์บอกซิล มาจากการเปรียบเทียบกรดอะมิโนของ CGTase จาก Bacillus sp. All กับแบคทีเรียสายพันธุ์อื่นที่ผลิต CGTase ให้ชื่อว่า PNB 5 HO-GTA (C/T) TATGATGTCAGCG-OH 3 และ PCC 5 HO-CAACAAGCA(G/C)AATTTCC-OH 3 ตามลำดับ แล้วทำการติดฉลากด้วย [gamma-32P] ที่ปลาย 5 [PO4]3- ของโอลิโกนิวคลีโอไทด์แล้วใช้เป็นตัวติดตามยีน CGTase ซึ่งเตรียมโดยการนำดีเอ็นเอของโครโมโซมจาก Bacillus sp. All ที่ย่อยด้วยเรสติกชันเอนไซม์ Sau 3AI แบบไม่สมบูรณ์มาเชื่อมกับตำแหน่ง BamHI บนเวกเตอร์ pUC18 แล้วเคลื่อนย้ายรีคอมบิแนนท์พลาสมิดเข้าสู่เซลล์เข้าเรือน E. coli strain DH5alpha โดยการติดตามด้วยวิธีโคโลนีไฮบริไดเซชัน วิธีติดตามแอคติวิตีในการย่อยแป้งแล้วเกิด clear zone และติดตามแอคติวิตีในหลอดทดลองดด้วยวิธี Dextrinizing activity, Phenol red inclusion complex test (PICT) และ CD-trichloroethylene assay พบว่ามี 5 ทรานสฟอร์แมนท์ที่สามารถผลิต CGTase โดย ทรานสฟอร์แมนท์ 909 แสดงแอคติวีตีสูงที่สุดแต่ต่ำกว่า Bacillus sp. All ดังนั้นจึงทำการศึกษาแหล่งที่ให้ Dextrinizing activity พบว่า ที่บริเวณนอกเซลล์ periplasmic space และตะกอนเซลล์มีแอคติวิตี 87.5, 11.7 และ 1.3 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ผลการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ CDs ด้วย HPLC พบว่า CGTase ของทรานสฟอร์มแมนท์ 909 ให้อัตราส่วน alpha-:beta-:gamma-CD เป็น 1:4.6:1.6 และแสดงสมบัติเหมือน CGTase ของ Bacillus sp. All เมื่อตรวจสอบด้วยพอลีอะครีละไมล์เจลอิเลคโตรโฟรีซีส