SINTESIS, KARAKTERISASI DAN EVALUASI IN-VITRO LIPOPEPTIDA DAN LIPOSOM BERBASIS OLIGOPEPTIDA SEBAGAI KANDIDAT PENGHANTAR MATERI GENETIK

• Main Author: Tarwadi
• Format: Dissertations
• Language: Indonesia
• Online Access: https://digilib.itb.ac.id/gdl/view/51582
• Institution: Institut Teknologi Bandung

Terapi genetik menggunakan sistem pembawa (vektor) non-virus berpotensi dapat dimanfaatkan secara komersial karena relatif murah, aman, stabil dan mudah diproduksi dalam skala komersial dibandingkan dengan pembawa berbasis virus. Namun demikian, efisiensi penghantaran material genetik menggunakan pembawa non-virus masih sangat rendah. Pembawa material genetik berbasis peptida dan lipopeptida umumnya mempunyai sitotoksistas yang rendah, mampu menembus membrane sel dan dapat diproduksi dengan mudah. Untuk mendapatkan vektor non-virus yang efisien dan aman, telah dirancang dan disintesa satu seri agen transfeksi lipopeptida sederhana (BM 700-1300 Da) yang terdiri dari rantai alkil lauril (C-12) atau palmitil (C-16), asam amino sistein, 1-5 histidin, dan 1-3 lisin. Molekul lipopeptida didisain untuk dapat memfasilitasi terjadinya dimerisasi melalui asam amino sistein yang mempunyai gugus tiol (SH), mengikat molekul DNA pada pH netral melalui ikatan ionik dengan lisin, dan menghindari degradasi enzimatik dalam endosom dengan adanya histidin melalui mekanisme mirip “proton sponge”. Studi penambatan dan simulasi dinamik molekul dilakukan untuk mempelajari kemungkinan senyawa lipopeptida dapat berikatan dengan molekul Importin-?yang merupakan protein kargo yang keluar masuk secara aktif antara kompartemen inti sel dan sitoplasma. Adanya ikatan antara Importin-?dan lipopeptida berpotensi mempengaruhi proses penghantaran secara aktif DNA ke dalam inti sel. Hasil studi in-silico menunjukkan bahwa Lau-CK2H dan Pal- CK2H2 secara teoritis dapat berinteraksi dengan molekul Importin-?dan dapat terlibat dalam proses transport molekul genetik ke dalam inti sel. Kedua molekul lipopeptida tersebut memiliki energi ikatan yang lebih rendah (Lau-CK2H: -6,3 kkal/mol dan Pal-CK2H2: -6,2 kkal/mol) dibandingkan dengan ligan asli Importin- ?, yaitu NLS (-5,4 kkal/mol). Jenis rantai alkil, jumlah dan jenis asam amino penyususun molekul lipopeptida sangat mempengaruhi kemampuan dalam membentuk kompleks dengan DNA dan melindunginya dari pengaruh DNase. Hasil studi in-vitro menunjukkan bahwa efisiensi transfeksi (ng luciferase/mg protein) menggunakan gen pengkode luciferase (pCMVLuc) dari setiap molekul lipopeptida pendek jauh lebih tinggi dibandingkan dengan poly(L-lysine) yang tidak memiliki kapasitas menghindari degradasi enzimatik dalam endosom. Bahkan, dua molekul lipopeptida (Pal-CK2H2 dan Pal-CK3H2) mampu menghantarkan pCMVLuc sebanding atau sedikit lebih baik dibandingkan polyethyleneimine (PEI). Ekspresi gen pengkode luciferase yang difasilitasi oleh lipopeptida sederhana dapat ditingkatkan menjadi 8-kali lebih besar dengan adanya klorokuin. Namun, ekspresi luciferase turun secara dratis saat ditambahkan penghambat vacuolar H (+)- ATPase bafilomycin A1. Menariknya, nilai ekspresi luciferase kembali ke nilai awal jika klorokuin ditambahkan ke media transfeksi. Ko-transfeksi menggunakan PEI dapat meningkatkan efisiensi transfeksi lipopeptida sampai 50-kali. PEI mungkin mempengaruhi karakteristik kompleks lipopeptide/DNA dan proses penghantaran dalam sitoplasma. Senyawa lipopeptida yang lebih panjang mengandung sekuen peptida yang dikenal sebagai trans-aktivator transkripsi (TAT: YGRKKRRQRRR) dan peptida pendek yang dikenal sebagai sekuen inti sel (NLS: PKKKRKV) didisain dengan tujuan untuk meningkatkan kemampuan lipopeptida dalam menembus membran sel. Lipopeptida yang lebih panjang (BM 3,3 kDa) dan oligopeptida TAT- NLS (BM 3,0 kDa) disintesa dengan alat pensistesa peptida menggunakan prinsip sintesa peptida fase padat berbasis Fmoc. Data in-vitro menunjukkan, sekuen TAT- NLS pada lipopeptida memberikan keuntungan antara lain dapat mengikat DNA dan melindunginya dari degradasi DNase lebih efektif dibandingkan lipopeptida pendek. Oligopeptida dan lipopeptida yang mengandung sekuen TAT-NLS dapat membentuk nanopartikel dengan molekul DNA yang stabil sampai dengan 20 hari. Analisis menggunakan TEM menunjukkan bahwa kompleks lipopeptide/DNA membentuk nanopartikel yang homogen dengan ukuran ~120 nm. Uji sitotoksisitas pada sel CHO-K1 dan HepG2 menunjukkan senyawa oligopeptida dan lipopeptida lebih mana bagi sel dibandingkan dengan PLL dan Lipofectamine TM -2000. Studi transfeksi menggunakan plasmid pengkode protein yang berpendar hijau (Green Fluorescence Protein, pCSII-EF-AcGFP) pada sel HepG2 menunjukkan ekspresi GFP terlihat dengan jelas pada perbandingan muatan lipopeptide/DNA: 4.0-8.0. Liposom yang diformulasi dari oligopeptida berbasis TAT-NLS dengan lipid netral DOPE dapat meningkatkan ekspresi GFP pada sel HepG2 sebanding atau bahkan sedikit lebih baik dibandingkan produk komersial Lipofectamine TM -2000. Hal ini menunjukkan bahwa agen transfeksi berbasis peptida yang terdiri dari rantai alkil palmitil dan sekuen TAT-NLS dapat berikatan dan membentuk kompleks dengan molekul DNA secara efektif, melindunginya dari degradasi enzimatik, membentuk nanopartikel yang stabil dan homogen, mempunyai sitotoksistas yang rendah, dan berpotensial sebagai pembawa material genetik. Agen transfeksi berbasis peptida perlu dioptimasi lebih lanjut dengan menggunakan jenis rantai alkil yang bervariasi (rantai alkil jenuh atau rantai alkil tidak jenuh), dan jenis serta urutan asam amino (linier atau bercabang) yang berbeda. Formulasi liposom dari agen transfeksi berbasis peptida (lipopeptida atau oligopeptida) dengan jenis lipid dan surfaktan yang berbeda untuk mendapatkan agen transfeksi yang terbaik untuk keperluan penghantaran material genetik secara in-vitro maupun in-vivo.