Purification and characterization of antimicrobial peptides from the sandworm Perinereis nuntia savigny
Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2007
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | Theses and Dissertations |
| Language: | English |
| Published: |
Chulalongkorn University
2014
|
| Online Access: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/41961 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Institution: | Chulalongkorn University |
| Language: | English |
| id |
th-cuir.41961 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
Chulalongkorn University |
| building |
Chulalongkorn University Library |
| country |
Thailand |
| collection |
Chulalongkorn University Intellectual Repository |
| language |
English |
| description |
Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2007 |
| author2 |
Amorn Petsom |
| author_facet |
Amorn Petsom Supissara Techaprempreecha |
| format |
Theses and Dissertations |
| author |
Supissara Techaprempreecha |
| spellingShingle |
Supissara Techaprempreecha Purification and characterization of antimicrobial peptides from the sandworm Perinereis nuntia savigny |
| author_sort |
Supissara Techaprempreecha |
| title |
Purification and characterization of antimicrobial peptides from the sandworm Perinereis nuntia savigny |
| title_short |
Purification and characterization of antimicrobial peptides from the sandworm Perinereis nuntia savigny |
| title_full |
Purification and characterization of antimicrobial peptides from the sandworm Perinereis nuntia savigny |
| title_fullStr |
Purification and characterization of antimicrobial peptides from the sandworm Perinereis nuntia savigny |
| title_full_unstemmed |
Purification and characterization of antimicrobial peptides from the sandworm Perinereis nuntia savigny |
| title_sort |
purification and characterization of antimicrobial peptides from the sandworm perinereis nuntia savigny |
| publisher |
Chulalongkorn University |
| publishDate |
2014 |
| url |
http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/41961 |
| _version_ |
1681413219253485568 |
| spelling |
th-cuir.419612016-07-02T12:52:14Z Purification and characterization of antimicrobial peptides from the sandworm Perinereis nuntia savigny การทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติของเพปไทด์ที่มีฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์จากเพรียงทราย Perinereis nuntia savigny Supissara Techaprempreecha Amorn Petsom Chanya Chaicharoenpong Nanthika Khongcharoenporn Chulalongkorn University. Faculty of Science Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2007 Sandworm, Perinereis nuntia Savigny, (class Polychaeta) is widely used as live food in aquatic animal industry due to its nutritional values which are essential for maturation in many aquaculture species. Although farmed and wild sandworms are different in both diet and habitat, their nutritional values have never been comparatively reported. The proximate composition of farmed sandworm fed with a commercial shrimp diet and wild sandworm caught from shore line of Chonburi, Thailand, were investigated. Protein and fat contents in farmed and wild sandworms were not significantly different. Moisture content of wild animal was significantly higher than that of farmed animal while the ash content was in the contrary. The fatty acid profile of major saturated fatty acids (SFA), monounsaturated fatty acids (MUFA) and polyunsaturated fatty acids (PUFA) in both groups of sandworm were C16:0, C18:1 and C18:2 respectively. SFA and MUFA contents of wild sandworm were significantly higher, while its PUFA content was significantly lower than that of farmed sandworm. Amino acid profile of both groups of sandworm was not different and the major amino acids were glutamic acid and aspartic acid in both groups of worm. Mineral contents in farmed and wild sandworms were significantly different except potassium. The cholesterol and vitamin A contents in wild sandworm were higher than those of farmed sandworm while vitamin C, D3 and E contents were in contrary and vitamin B1was in the same order. Sandworms live in sandy beach which rich in microorganism and their abundance in this type of environment suggest that they have developed efficient immunodefense. They are able to protect themselves against invading pathogens due to efficient innate defense mechanism, one is antimicrobial peptides (AMPs). The AMPs were isolated and purified from sandworm P. nuntia tissue and coelomic fluid. The general protocol of peptides purification method including acid extraction, purification step by gel-filtration chromatography, solid phase extraction and reverse phase HPLC. Moreover, sandworms were challenged by Vibio harveyi before extraction and found the highest antimicrobial activity after 24 hr challenged. Each purified step was checked for antimicrobial activity by paper disc method against gram positive bacteria Bacillus subtilis. Three AMPs; AMP-F5(P), AMP-F15(P) and AMP-F40(P) were isolated from sandworm and they were mixed peptides. Molecular weight of major peptided of AMP-F5(P), AMP-F15(P) and AMP-F40(P) were 2461.797, 8564.595 and 2459.779 Daltons, respectively. Only AMP-F5(P) showed activity against B. subtilis after purification by the last step. Furthermore, 0.26 g of AMP-F5(P) was found from 1 g of wet weight of fresh sandworm. เพรียงทราย Perinereis nuntia Savigny (คลาสโพลีคีท) ถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในอุตสาหกรรมเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ เนื่องจากคุณค่าทางอาหารของเพรียงทรายสำคัญต่อการเจริญพันธุ์ของสัตว์น้ำหลายชนิด เพรียงทรายที่ใช้นำมาเป็นอาหารสัตว์น้ำเศรษฐกิจเหล่านี้นำมาจากเพรียงทรายในธรรมชาติและอาจนำโรคมาสู่สัตว์น้ำที่เลี้ยงได้ ดังนั้นฟาร์มสัตว์น้ำต่างๆนิยมที่จะใช้เพรียงทรายจากฟาร์มมากกว่าจับจากธรรมชาติ แต่เนื่องจากว่าเพรียงทรายจากฟาร์มและเพรียงธรรมชาติมีความแตกต่างกันในเรื่องของอาหารและแหล่งที่อยู่อาศัย ซึ่งคุณค่าทางอาหารจากตัวเพรียงทรายของทั้งสองแหล่งยังไม่เคยมีการศึกษาเปรียบเทียบกันมาก่อน งานวิจัยนี้จึงทำการศึกษาเปรียบเทียบคุณค่าทางอาหารของเพรียงทรายจากฟาร์มและจากธรรมชาติ พบว่าโปรตีนและไขมันจากเพรียงทรายฟาร์มและเพรียงทรายธรรมชาติ มีค่าแตกต่างอย่างไม่มีนัยสำคัญ ส่วนความชื้นของเพรียงธรรมชาติมีค่าสูงกว่าเพรียงฟาร์มอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่เถ้านั้นตรงกันข้าม ในเพรียงทรายฟาร์มสูงกว่าในเพรียงทรายธรรมชาติอย่างมีนัยสำคัญ เมื่อวิเคราะห์ส่วนประกอบของกรดไขมันในเพรียงทรายทั้ง 2 แหล่ง พบว่ากรดไขมันหลักในกลุ่ม Saturated fatty acid (SFA) Monounsaturated fatty acid (MUFA) และ Polyunsaturated fatty acid (PUFA) ของเพรียงทรายจากทั้ง 2 แหล่งเหมือนกันคือ C16:0 C18:1 และ C18:2 ตามลำดับ ปริมาณกรดไขมันรวมในกลุ่ม SFA และ MUFA ในเพรียงทรายธรรมชาติพบสูงกว่าในเพรียงทรายฟาร์มอย่างมีนัยสำคัญ ในทางตรงกันข้ามกรดไขมันรวมในกลุ่มของ PUFA นั้น พบในเพรียงทรายฟาร์มสูงกว่าในธรรมชาติอย่างมีนัยสำคัญ และเมื่อวิเคราะห์ส่วนประกอบกรดอะมิโนในตัวเพรียงทรายทั้ง 2 แหล่ง พบว่าประกอบด้วยกรดอะมิโนที่ไม่ต่างกันทั้งชนิดและปริมาณ โดยที่กรดอะมิโนหลักที่พบในเพรียงทรายทั้ง 2 กลุ่มคือ กรดกลูตามิคและกรดแอสปาติก ส่วนปริมาณเกลือแร่ที่วิเคราะห์ได้นั้น พบว่าทั้งในเพรียงทรายฟาร์มและเพรียงทรายธรรมชาติมีปริมาณเกลือแร่ที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทั้งหมด ยกเว้นโพแทสเซียมเพียงชนิดเดียวที่แตกต่างอย่างไม่มีนัยสำคัญ เมื่อวิเคราะห์ปริมาณคลอเลสเตอรอลและวิตามินต่างๆในเพรียงทราย พบว่าคลอเลสเตอรอลและวิตามินเอในเพรียงทรายธรรมชาติมีปริมาณสูงกว่าเมื่อเทียบกับเพรียงทรายฟาร์ม ในทางตรงกันข้ามวิตามินซี ดี 3 และอี ในเพรียงทรายฟาร์มกลับมีปริมาณมากกว่าเพรียงทรายธรรมชาติ ส่วนวิตามินบี 1 นั้นพบว่ามีปริมาณเท่ากันในเพรียงทรายจากทั้ง 2 แหล่ง เพรียงทรายนั้นอาศัยอยู่ตามหาดทรายซึ่งเต็มไปด้วยจุลินทรีย์จำนวนมาก แสดงว่าเพรียงทรายมีการพัฒนาระบบภูมิคุ้มกันได้อย่างมีประสิทธิภาพ ระบบภูมิคุ้มกันของเพรียงทรายที่ใช้ต่อต้านเชื้อจุลินทรีย์คือ innate immunity ซึ่งมีหลายแบบ และหนึ่งใน innate immunity คือเพปไทด์ที่มีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์ antimicrobial peptides (AMPs) ในการทดลองนี้ AMPs จากเนื้อเยื่อและน้ำเลือดของเพรียงทราย P. nuntia ได้ถูกสกัดแยกและทำให้บริสุทธิ์ การทำให้บริสุทธิ์ประกอบไปด้วยการสกัดด้วยสารละลายกรด การแยกเพปไทด์ด้วยวิธีเจลฟิลเตรชั่น solid phase extract และด้วย reverse phase HPLC นอกจากนี้ยังได้ทำการกระตุ้นเพรียงทรายให้ผลิตสาร AMPs ออกมาจำนวนมากขึ้นด้วยการทำให้ติดเชื้อแบคทีเรีย Vibrio harveyi และพบว่าหลังจากการทำให้ติดเชื้อไปแล้ว 24 ชั่วโมงสารสกัดหยาบเพรียงทรายจะมีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์ได้มากที่สุด ซึ่งในการทดลองนี้ทุกขั้นตอนที่ทำการทำให้บริสุทธิ์จะตรวจสอบฤทธิ์ในการยับยั้งเชื้อจุลินทรีย์ด้วยวิธี paper disc และใช้เชื้อแบคทีเรียแกรมบวก Bacillus subtilis เป็นเชื้อทดสอบ จากการทดลองสามารถแยกสาร AMPs จากเพรียงทรายได้ 3 ตัว คือ AMP-F5(P) AMP-F15(P) และ AMP-F40(P) ซึ่งเป็นเพปไทด์ผสม และมีน้ำหนักโมเลกุลของเพปไทด์หลักของ AMP-F5(P) AMP-F15(P) และ AMP-F40(P) เท่ากับ 2461.797 8564.595 และ 8459.779 ดาลตันตามลำดับ แต่มีเพียง AMP-F5(P) เท่านั้นที่ยังแสดงฤทธิ์ยับยั้งเชื้อ B. subtilis เมื่อผ่านขั้นตอนสุดท้ายของการทำให้บริสุทธิ์ นอกจากนี้ AMP-F5(P) จากเพรียงทรายที่สกัดได้มีปริมาณ 0.26 ไมโครกรัมต่อน้ำหนักเพรียงทรายสด 1 กรัม 2014-03-25T13:12:34Z 2014-03-25T13:12:34Z 2007 Thesis http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/41961 en Chulalongkorn University application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf Chulalongkorn University |