Purification and characterization of thermostable protease
Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2001
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | Theses and Dissertations |
| Language: | English |
| Published: |
Chulalongkong University
2009
|
| Subjects: | |
| Online Access: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/9537 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Institution: | Chulalongkorn University |
| Language: | English |
| id |
th-cuir.9537 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
th-cuir.95372009-08-03T10:33:30Z Purification and characterization of thermostable protease การทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติของโปรตีเอสที่เสถียรต่ออุณหภูมิสูง Chaiyasit Sittiwet Napa Siwarungson Chulalongkorn University. Faculty of Science Proteolytic enzymes Nacordia corallina Chemicals -- Purification Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2001 Bacteria produced thermostable protease were isolated from soil of hot spring at Amphor Hui Sai Kwao, Chiang Rai province. It was identified by biochemical tests and 16S rRNA gene sequence as Bacillus mycoides. The protease production was conducted on optimum condition which consisted of peptone medium at initial pH 8.0, inoculum size of 1.0%, initial nitrogen content of 1.4%, at 37 ํC and peptone was replaced by tryptone as a nitrogen source. This thermostable protease had optimum activity at 60 ํC and pH 8.0 in 10mM Tris -HCl buffer. The thermostable protease was purified by 50% acetone precipitation and Sephadex G-75 column chromatography with 0.46% yield and specific activity of 30.97 units/mg protein. The results from SDS-PAGE and Sephadex G-75 column chromatography indicated that the molecular mass of thermostable protease was 27,600 Da. The loss of activity in the presence of PMSF and EDTA indicated the significant of serine in active site of protease and metal ion had an important on protease activity. Thermostable protease exhibited substrate specificity with the K[subscript m] on casein and azocasein 125.00 mg/ml and 26.13 mg/ml while the V[subscript max] on casein and azocasein were 3.80 Units/mg protein and 17.00 Units/mg protein. The application of this protease towards protein wastes from tuna canned industry was studied. The highest digested product with 3.9% nitrogen content was obtained by protease digestion of the mixture of viscera and blood แบคทีเรียที่สามารถผลิตโปรตีเอสที่เสถียรต่ออุณหภูมิสูงซึ่งถูกแยกจากดินบริเวณน้ำพุร้อนจาก อำเภอห้วยทรายขาว จังหวัดเชียงราย ได้ถูกนำมาจำแนกสายพันธุ์โดยวิธีการทดสอบสมบัติทางชีวเคมีและการเปรียบเทียบลำดับดีเอ็นเอบริเวณ 16S rRNA gene พบว่าเป็น Bacillus mycoides จากการหาภาวะที่เหมาะสมในการวัดแอคติวิตีของเอนไซม์ พบว่าภาวะที่เอนไซม์มีแอคติวิตีสูงสุดคือ 37 ํC, pH 8.0 (10mM Tris-HCl buffer) เมื่อทำการหาภาวะที่เหมาะสมในการเลี้ยงแบคทีเรียชนิดนี้ในขวดเขย่าขนาด 1 ลิตร โดยใช้ปริมาณอาหารเหลว 300 มล. เพื่อผลิตเอนไซม์พบว่าภาวะที่เหมาะสมคือ การเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 ํC pH 8.0 ในอาหารสูตรเปปโตนซึ่งใช้เชื้อตั้งต้น 1.0% โดยมีทริปโตนเป็นแหล่งไนโตรเจนและมีปริมาณไนโตรเจนในอาหาร 1.4% โปรตีเอสที่เสถียรต่ออุณหภูมิสูงมีการทำงานสูงสุดที่ 60 ํC และ pH 8.0 ใน 10 mM Tris-HCl buffer การแยกโปรตีเอสให้บริสุทธิ์ ทำได้โดยตกตะกอนโปรตีนโดยการเติมอะซีโตนลงในน้ำเลี้ยงเชื้อให้มีความเข้มข้นสุทธิ 50% หลังจากนั้นจึงนำโปรตีนที่ได้ไปผ่านการแยกโดย Sephadex G-75 column chromatography ซึ่งผลิตได้ผลิตผลโปรตีเอส 0.46% และมีแอคติวิตีจำเพาะ 30.97 units/mg protein ผลการทดลองจาก SDS-PAGE และ Sephadex G-75 column chromatography แสดงว่าน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีเอสที่เสถียรต่ออุณหภูมิสูงเท่ากับ 27,600 Da การสูญเสียแอคติวิตีของเอนไซม์โดย PMSF และ EDTA แสดงว่ากรดอะมิโนซีรีนมีความจำเพาะของโปรตีเอสที่เสถียรต่ออุณหภูมิสูงต่อสารตั้งต้น คือ เคซีนและเอโซเคซีน พบว่าค่า Km = 125.00 mg/ml และ 26.13 mg/ml ตามลำดับ และค่า V[subscript max] = 3.8 Units/mg protein และ 17.00 Units/mg protein ตามลำดับการประยุกต์ของโปรตีเอสนี้ในการย่อยของเสียที่ได้จากโรงงานผลิตปลาทูน่ากระป๋องนั้นพบว่าโปรตีเอสสามารถย่อยของเสียทั้งสามชนิดได้ดีโดยเฉพาะอย่างยิ่ง ไส้ปลากับเลือดปลาซึ่งพบว่าปริมาณไนโตรเจนเพิ่มขึ้นสูงที่สุด 3.9% 2009-08-03T10:33:29Z 2009-08-03T10:33:29Z 2001 Thesis 9740309011 http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/9537 en Chulalongkorn University 853788 bytes application/pdf application/pdf Chulalongkong University |
| institution |
Chulalongkorn University |
| building |
Chulalongkorn University Library |
| country |
Thailand |
| collection |
Chulalongkorn University Intellectual Repository |
| language |
English |
| topic |
Proteolytic enzymes Nacordia corallina Chemicals -- Purification |
| spellingShingle |
Proteolytic enzymes Nacordia corallina Chemicals -- Purification Chaiyasit Sittiwet Purification and characterization of thermostable protease |
| description |
Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2001 |
| author2 |
Napa Siwarungson |
| author_facet |
Napa Siwarungson Chaiyasit Sittiwet |
| format |
Theses and Dissertations |
| author |
Chaiyasit Sittiwet |
| author_sort |
Chaiyasit Sittiwet |
| title |
Purification and characterization of thermostable protease |
| title_short |
Purification and characterization of thermostable protease |
| title_full |
Purification and characterization of thermostable protease |
| title_fullStr |
Purification and characterization of thermostable protease |
| title_full_unstemmed |
Purification and characterization of thermostable protease |
| title_sort |
purification and characterization of thermostable protease |
| publisher |
Chulalongkong University |
| publishDate |
2009 |
| url |
http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/9537 |
| _version_ |
1681410809403539456 |