Extra-Function of Ribosomal Protein L10a via Insulin Signaling Pathway
Doctor of Philosophy (Molecular Biology and Bioinformatics), 2021
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | Theses and Dissertations |
| Language: | English |
| Published: |
Prince of Songkla University
2023
|
| Subjects: | |
| Online Access: | http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/18161 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Institution: | Prince of Songkhla University |
| Language: | English |
| id |
th-psu.2016-18161 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
Prince of Songkhla University |
| building |
Khunying Long Athakravi Sunthorn Learning Resources Center |
| continent |
Asia |
| country |
Thailand Thailand |
| content_provider |
Khunying Long Athakravi Sunthorn Learning Resources Center |
| collection |
PSU Knowledge Bank |
| language |
English |
| topic |
Ribosomal Protein L10a Extra–ribosomal function Insulin Signaling Pathway Insulin receptor Drosophila Genetics Proteins Analysis Insulin resistance |
| spellingShingle |
Ribosomal Protein L10a Extra–ribosomal function Insulin Signaling Pathway Insulin receptor Drosophila Genetics Proteins Analysis Insulin resistance Netnapa Chaichanit Extra-Function of Ribosomal Protein L10a via Insulin Signaling Pathway |
| description |
Doctor of Philosophy (Molecular Biology and Bioinformatics), 2021 |
| author2 |
Wilaiwan Chotigeat |
| author_facet |
Wilaiwan Chotigeat Netnapa Chaichanit |
| format |
Theses and Dissertations |
| author |
Netnapa Chaichanit |
| author_sort |
Netnapa Chaichanit |
| title |
Extra-Function of Ribosomal Protein L10a via Insulin Signaling Pathway |
| title_short |
Extra-Function of Ribosomal Protein L10a via Insulin Signaling Pathway |
| title_full |
Extra-Function of Ribosomal Protein L10a via Insulin Signaling Pathway |
| title_fullStr |
Extra-Function of Ribosomal Protein L10a via Insulin Signaling Pathway |
| title_full_unstemmed |
Extra-Function of Ribosomal Protein L10a via Insulin Signaling Pathway |
| title_sort |
extra-function of ribosomal protein l10a via insulin signaling pathway |
| publisher |
Prince of Songkla University |
| publishDate |
2023 |
| url |
http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/18161 |
| _version_ |
1767194632169455616 |
| spelling |
th-psu.2016-181612023-05-16T03:14:06Z Extra-Function of Ribosomal Protein L10a via Insulin Signaling Pathway Netnapa Chaichanit Wilaiwan Chotigeat Faculty of Science (Molecular Biotechnology and Bioinformatics) คณะวิทยาศาสตร์ สาขาวิชาชีววิทยาโมเลกุลและชีวสารสนเทศ Ribosomal Protein L10a Extra–ribosomal function Insulin Signaling Pathway Insulin receptor Drosophila Genetics Proteins Analysis Insulin resistance Doctor of Philosophy (Molecular Biology and Bioinformatics), 2021 Ribosomal protein L10a (RpL10a) is one of several ribosomal proteins which has functions besides protein synthesis in the ribosome. Many reports recently revealed the extra–ribosomal function of RpL10a, including a role in oogenesis, spermatogenesis, ovarian development, organogenesis, and embryogenesis. In Drosophila melanogaster, the overexpression of the shrimp RpL10a resulted in the loss of red pigment in the eye center. This finding suggests that RpL10a also plays a role in cell proliferation. In contrast, the lack of RpL10Ab (RpL10Ab-/-) in the germline of fruit flies showed the disappearance of the follicle cells surrounding the egg chamber, similar to the insulin receptor mutants (InR-/-), indicating that RpL10a plays a role in oogenesis. Normally, InR is the transmembrane receptor of the insulin signaling pathway that plays a key role in cell development, cell division, metabolism regulation especially the role in glucose homeostasis regulation. Therefore, RpL10a may be involved in the step of regulation of InR to regulate cell development and metabolism. To determine whether RpL10a is involved in regulating glucose homeostasis, carbohydrate content was observed in the eyes of normal and overexpressed flies by using an anthrone-sulfuric acid colorimetric assay. In this study, the function of shrimp RpL10a involved in insulin receptor (InR) and carbohydrate metabolism were investigated. In the eyes of RpL10a–overexpressed flies, the expression of InR was extensively increased in mRNA level and protein level, determined by qPCR and immunohistochemistry, respectively. Moreover, In the RpL10a–overexpressed eyes of the mutant fly showed the highly phosphorylated insulin signaling mediators such as Akt and dFOXO, whereas the mutant flies showed the reduction of the glycogen. This finding revealed that shrimp RpL10a affects cell proliferation and glycogenolysis through the insulin signaling pathway. Besides, The interaction between RpL10a and InR was performed both in silico and in vitro binding. The shrimp RpL10a protein and the human InR protein were obtained as a silico binding model. The ClusPro software indicated that RpL10a could interact with InR at the difference site on fibronectin type III (FnIII) domain of insulin bound to InR. Then, to reduce the culture time and to control the culture condition easily, the study of shrimp RpL10a function was performed in CHO-S cell line. The in vitro study results, including pull-down assay and immunofluorescence assay, confirmed the binding of the proteins. The binding of the two proteins could stimulate the insulin signaling pathway by binding at the FnIII domain of InR and increased the carbohydrate utilization while the lipid metabolism was unchanged. Also, the effect of RpL10a on glucose metabolism was investigated in insulin resistance conditions. The CHO-S cells were induced to insulin resistance under high glucose conditions before stimulating with RpL10a. After the healthy cells and insulin-resistant cells (IRCs) were incubated with RpL10a, RpL10a could induce glucose uptake by the IRCs better than healthy cells. Moreover, RpL10a could induce the expression of hexokinase in glycolysis and decreased the expression of glucose-6-phosphatase in gluconeogenesis. These findings suggested that RpL10a could alleviate the insulin resistance by inducing the glucose uptake into the cells, activating glycolysis, and suppressing glucose synthesis in IRCs induced under high glucose conditions. From this important function, RpL10a may have a function as an insulin-mimetic for insulin-resistant diabetes treatment. 1. The PSU-Ph.D. Scholarship 2. Research Grant for Thesis 3. The Royal Golden Jubilee Ph.D. Program (RGJ-Ph.D. Program) from the Thailand Research Fund (TRF) (4.JP.PS/56/B.1) Ribosomal protein L10a (RpL10a) เป็นหนึ่งในโปรตีนของไรโบโซมที่มีหน้าที่นอกเหนือจากการผลิตโปรตีนในไรโบโซม ปัจจุบันมีงานวิจัยหลายฉบับที่แสดงให้เห็นว่า RpL10a มีบทบาทหน้าที่ที่นอกเหนือจากหน้าที่ของไรโบโซมอลโปรตีน (extra–ribosomal function) ซึ่งได้แก่ บทบาทในการควบคุมการสร้างเซลล์สืบพันธุ์เพศเมีย (oogenesis), กระบวนการสร้างตัวอสุจิ (spermatogenesis), การพัฒนาของรังไข่ (ovarian development), การพัฒนาของอวัยวะ (organogenesis) และการพัฒนาของตัวอ่อน (embryogenesis) การแสดงออกของ RpL10a ที่มากเกินไปในแมลงหวี่ส่งผลให้จอตาของแมลงมีการเพิ่มจำนวนเซลล์ที่มากผิดปกติและมีการสูญเสียเม็ดสีที่กลางจอตา ความผิดปกติเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า RpL10a มีบทบาทเกี่ยวข้องกับการแพร่ขยายหรือการเพิ่มจำนวนเซลล์ (cell proliferation) ในทางกลับกัน การขาด RpL10a ในรังไข่แมลงหวี่ส่งผลให้ฟอลลิเคิลเซลล์รอบๆ เซลล์ไข่ขาดหายไป ซึ่งลักษณะความผิดปกติดังกล่าว มีความคล้ายคลึงกับลักษณะความผิดปกติของรังไข่ที่ขาดตัวรับอินซูลิน (insulin receptor) ความผิดปกตินี้แสดงให้เห็นว่า RpL10a มีบทบาทเกี่ยวข้องกับการสร้างเซลล์สืบพันธุ์เพศเมีย ซึ่งโดยปกติ ตัวรับอินซูลินเป็นโปรตีนตัวรับใน insulin signaling pathway ที่มีบทบาทในการควบคุมการพัฒนาและการแบ่งตัวของเซลล์ ควบคุมอัตราการเผาผลาญโดยเฉพาะการควบคุมสภาวะสมดุลของกลูโคส ดังนั้นอาจเป็นไปได้ว่า RpL10a มีความเกี่ยวข้องกับการควบคุมการทำงานของตัวรับอินซูลินเพื่อควบคุมการเผาผลาญและการพัฒนาของเซลล์ เพื่อศึกษาความเกี่ยวข้องของ RpL10a กับการควบคุมสภาวะสมดุลของกลูโคส จึงทำการตรวจสอบปริมาณคาร์โบไฮเดรตในตาของแมลงหวี่ที่มีการแสดงออกของ RpL10a ที่มากเกินไป (RpL10a–overexpressed flies) เปรียบเทียบกับแมลงหวี่ในกลุ่มควบคุม โดยใช้ anthrone-sulfuric acid colorimetric assay งานวิจัยนี้ทำการศึกษาการทำงานของ RpL10a ที่มีความเกี่ยวข้องกับตัวรับอินซูลินและการเผาผลาญคาร์โบไฮเดรต ซึ่งจากผลการทดลองโดยเทคนิค qPCR และ immunohistochemistry พบว่าในแมลงหวี่ที่มีการแสดงออกของ RpL10a ที่มากเกินไปมีการแสดงออกของตัวรับอินซูลินเพิ่มขึ้นทั้งในระดับ mRNA และระดับโปรตีน ตามลำดับ นอกจากนี้โปรตีนที่เป็นตัวกลางในการส่งสัญญาณของอินซูลิน ได้แก่ Akt และ dFOXO ในแมลงหวี่ที่มีการแสดงออกของ RpL10a ที่มากเกินไป มีการเพิ่มขึ้นของการเติมหมู่ฟอสเฟตซึ่งเป็นรูปแบบการส่งสัญญาณใน pathway ในขณะที่ปริมาณไกลโคเจนลดลงในแมลงหวี่ที่มีการแสดงออกของ RpL10a ที่มากเกินไป การค้นพบนี้แสดงให้เห็นว่า RpL10a มีความเกี่ยวข้องกับการแพร่ขยายหรือการเพิ่มจำนวนเซลล์และการสลายไกลโคเจน (Glycogenolysis) และเพื่อศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่าง RpL10a กับ ตัวรับอินซูลิน จึงทำการตรวจสอบการจับกันของโปรตีนทั้ง 2 โดยใช้เทคนิคทางชีวสารสนเทศ (bioinformatics) โดยการทำนายการจับกันด้วยโปรแกรม (In Silico) ผลการจำลองจากโปรแกรม ClusPro แสดงให้เห็นว่า RpL10a จากกุ้งสามารถจับกับตัวรับอินซูลินจากมนุษย์ได้ในบริเวณที่ต่างจากการจับของอินซูลินบนตัวรับอินซูลินที่ fibronectin type III (FnIII) domain ทั้งนี้เพื่อลดระยะเวลาในการเพาะเลี้ยงสัตว์ทดลองและเพื่อควบคุมความแปรผันของสภาวะการเพาะเลี้ยงได้ง่ายขึ้น จึงทำการศึกษาการทำงานของ RpL10a ต่อใน Chinese hamster ovary (CHO-S) cell line โดยตรวจสอบผลการจับกันของโปรตีนทั้งสองที่ได้จากโปรแกรมในหลอดทดลอง (in vitro) โดยใช้โปรตีน RpL10a จากกุ้ง และใช้ตัวรับอินซูลินจาก CHO-S cells เป็นโปรตีนต้นแบบในการจำลองการจับกัน และสามารถยืนยันตำแหน่งการจับกันได้จากผลการตรวจสอบการจับกันของ RpL10a และตัวรับอินซูลินในตำแหน่งที่ทำนายจาก ClusPro ด้วย pull-down assay และ immunofluorescence assay การจับกันของโปรตีนทั้งสองทำให้ RpL10a สามารถกระตุ้น insulin signaling pathway ได้ และเหนี่ยวนำให้เกิดการใช้คาร์โบไฮเดรตเพิ่มขึ้น ในขณะที่ไม่ส่งผลกระทบต่อการเผาผลาญไขมัน นอกจากนั้นงานวิจัยนี้ยังได้ศึกษาผลของ RpL10a ต่อการเผาผลาญกลูโคสในสภาวะที่ดื้อต่ออินซูลิน โดยการเหนี่ยวนำภายใต้สภาวะกลูโคสที่สูงเพื่อให้ CHO-S cells เข้าสู่สภาวะดื้อต่ออินซูลินก่อนที่จะกระตุ้นด้วย RpL10a หลังจากการกระตุ้นด้วย RpL10a พบว่า RpL10a สามารถกระตุ้นให้เซลล์นำกลูโคสเข้าสู่เซลล์ได้ดีในสภาวะที่ดื้อต่ออินซูลินเมื่อเทียบกับเซลล์ปกติ อีกทั้ง RpL10a ยังสามารถกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ hexokinase ใน กระบวนการสลายกลูโคส (glycolysis) และลดการทำงานของเอนไซม์ glucose-6-phosphatase ในกระบวนการสังเคราะห์กลูโคส (gluconeogenesis) การค้นพบเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า RpL10a สามารถบรรเทาอาการดื้อต่ออินซูลินโดยการกระตุ้นการใช้กลูโคสและยับยั้งกระบวนผลิตกลูโคสของเซลล์ในสภาวะที่ดื้อต่ออินซูลินภายใต้การเหนี่ยวนำด้วยสภาวะความเข้มข้นกลูโคสสูง จากบทบาทที่นอกเหนือจากหน้าที่ของ ribosomal protein ที่กล่าวมานี้ เป็นไปได้ว่า RpL10a อาจทำหน้าที่เป็นตัวเลียนแบบอินซูลิน (insulin-mimetic) ตัวหนึ่งในการรักษาเบาหวานได้ 2023-05-16T03:13:48Z 2023-05-16T03:13:48Z 2021 Thesis http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/18161 en Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Thailand http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/th/ application/pdf Prince of Songkla University |