Gene Cloning Characterization of Lectin Containing Low-Density Lipoprotein Receptor Domain from Hemocytes of Fenneropenaeus merguiensis
Thesis (Ph.D., Biochemistry)--Prince of Songkla University, 2019
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | Theses and Dissertations |
| Language: | English |
| Published: |
Prince of Songkla University
2024
|
| Subjects: | |
| Online Access: | http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/19485 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Institution: | Prince of Songkhla University |
| Language: | English |
| id |
th-psu.2016-19485 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
Prince of Songkhla University |
| building |
Khunying Long Athakravi Sunthorn Learning Resources Center |
| continent |
Asia |
| country |
Thailand Thailand |
| content_provider |
Khunying Long Athakravi Sunthorn Learning Resources Center |
| collection |
PSU Knowledge Bank |
| language |
English |
| topic |
Lectins Molecular cloning |
| spellingShingle |
Lectins Molecular cloning Pattamaporn Kwankaew Gene Cloning Characterization of Lectin Containing Low-Density Lipoprotein Receptor Domain from Hemocytes of Fenneropenaeus merguiensis |
| description |
Thesis (Ph.D., Biochemistry)--Prince of Songkla University, 2019 |
| author2 |
Prapaporn Utarabhand |
| author_facet |
Prapaporn Utarabhand Pattamaporn Kwankaew |
| format |
Theses and Dissertations |
| author |
Pattamaporn Kwankaew |
| author_sort |
Pattamaporn Kwankaew |
| title |
Gene Cloning Characterization of Lectin Containing Low-Density Lipoprotein Receptor Domain from Hemocytes of Fenneropenaeus merguiensis |
| title_short |
Gene Cloning Characterization of Lectin Containing Low-Density Lipoprotein Receptor Domain from Hemocytes of Fenneropenaeus merguiensis |
| title_full |
Gene Cloning Characterization of Lectin Containing Low-Density Lipoprotein Receptor Domain from Hemocytes of Fenneropenaeus merguiensis |
| title_fullStr |
Gene Cloning Characterization of Lectin Containing Low-Density Lipoprotein Receptor Domain from Hemocytes of Fenneropenaeus merguiensis |
| title_full_unstemmed |
Gene Cloning Characterization of Lectin Containing Low-Density Lipoprotein Receptor Domain from Hemocytes of Fenneropenaeus merguiensis |
| title_sort |
gene cloning characterization of lectin containing low-density lipoprotein receptor domain from hemocytes of fenneropenaeus merguiensis |
| publisher |
Prince of Songkla University |
| publishDate |
2024 |
| url |
http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/19485 |
| _version_ |
1802995680638140416 |
| spelling |
th-psu.2016-194852024-06-19T03:31:58Z Gene Cloning Characterization of Lectin Containing Low-Density Lipoprotein Receptor Domain from Hemocytes of Fenneropenaeus merguiensis การโคลนยีนและศึกษาสมบัติของเลคตินที่มีโดเมน Low-Density Lipoprotein Receptor จากฮีโมไซท์ของกุ้งแชบ๊วย Pattamaporn Kwankaew Prapaporn Utarabhand Faculty of Science (Biochemistry) คณะวิทยาศาสตร์ ภาควิชาชีวเคมี Lectins Molecular cloning Thesis (Ph.D., Biochemistry)--Prince of Songkla University, 2019 As the pattern recognition molecules, lectins are related to many biological processes such as protein trafficking, cell signaling, pathogen recognition etc. These proteins are generally found in almost all living organisms. Almost lectins have a carbohydrate recognition domain (CRD). They can interact via CRD domain to the carbohydrate molecules on different types of cells including bacterial cells and viral particles. Since a lectin molecule has at least two binding sites that are specific to surface of cells, the protein causes cell agglutination when it attaches to specific carbohydrates on the cell surfaces. C-type lectin (CTL) is a group of lectin that requires Capt to complete its functions. There are several reports of CTLs in marine shrimp. The interaction of CTLs with shrimp pathogens activates various immune processes such as phagocytosis, encapsulation and prophenoloxidase activating system. These processes are important mechanisms to combat with shrimp pathogens. According to the elements in their molecules, shrimp CTLs are divided into 3 groups; CTLs with only one CRD domain, CTLs with dual CRD domains and CTLs with one CRD domain plus additional another domain. Although most common shrimp CTLS are classified in the first two groups, recent study reported that CTL containing CRD and low-density lipoprotein receptor class A domain (LDLR) of Litopenaeus vannamei and Marsupenaeus japonicus contributed in shrimp immune system against yellow head virus (YHV) and White spot syndrome virus (WSSV), respectively. In this study, we clarified the function of a CTL containing CRD and LDLR of F. merguiensis designated as FmLdlr and also illustrated the role of two domains (CRD and LDLR) of FmLdlr in the shrimp immune system. In addition, the previous studies concerning vitellogenin (Vg) which is a precursor protein in oogenesis of female shrimp found that transporting Vg from hepatopancreas (synthesized organ) to the ovary (target organ) via hemolymph relies on the receptor. Type of this Vg receptor is the LDLR family protein. Therefore, it is interesting to study a function of LDLR domain within FmLdlr molecule whether it is related to the vitellogenin transportation or not. The full-length cDNA of FmLdlr gene was cloned from hemocytes of F. merguiensis by rapid amplification of cDNA ends (RACE) method and RT-PCR. It contained 1425 bp including a 100 bp of 5' UTR, a 410 bp of 3' UTR and a 915 bp of open reading frame (ORF) sequence. The deduced amino acid sequence of FmLdlr was composed of 305 amino acid residues. The mature protein had a calculated molecular mass of 31.78 kDa and pl of 5. It contained a LDLR domain at the Nterminus and a CRD with a QAP motif at the C-terminus. The amino acid sequence alignment of FmLdlr showed the highest identity (89%) with LdlrLecl, the LDLRcontaining CTL from M. japonicus. RT-PCR result in different tissues showed that the expression of FmLdlr was detected only in hemocytes. After shrimp were inoculated with pathogens, the transcriptional expression levels of FmLdlr were detected by quantitative real time-PCR ( RT-PCR). Vibrio parahaemolyticus and WSSV challenge showed the similar results that the mRNA expression of FmLdir responded to the pathogens by being up-regulated significantly. The RNA interference-mediated knockdown of FmLdlr resulted in severe down-regulation of FmLdlr gene. The knockdown with pathogenic co-injection caused reducing in the median lethal time and increasing the cumulative mortality of shrimp. Recombinant proteins of FmLdlr (rFmLdlr) and its domains (rCRD and LDLR) were successfully produced in bacterial system and applied in the work to characterize function of this lectin. The results of bacterial agglutination test showed that rFmLdlr and its domains could agglutinate all kinds of tested bacteria including two gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus) and four Gram-negative bacteria (Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus, Escherichia coli, Salmonella typhi) at different concentrations. All agglutination was displayed in a Ca?t-dependent manner. Among recombinant proteins, rFmLdlr exhibited the maximal activity towards all tested microorganisms while rCRD had more activity than rLDLR. Moreover, all lectin recombinant proteins had the maximal activity against V. parahaemolyticus. The rFmLdlr and CRD could enhance the in vitro phagocytic activity and in vitro encapsulation of F. merguiensis hemocytes whereas LDLR could not. The rFmLdir could promote the in vivo bacterial clearance activity via the main functional CRD domain. FmLdlr and its domains had inhibitory effect on the growth of V. parahaemolyticus in a dose-dependent manner. ELISA assay demonstrated that rFmLdlr and CRD possessed the binding activity to all tested WSSV recombinant proteins (rVP15, rVP28 and rVP39A) at different affinities. ELISA was also used to detect the binding between recombinant proteins of lectin (rFmLdlr, rLDLR and TCRD) and purified native Vg. Recombinant proteins of the lectin could bind to Vg with different affinities while rLDLR showed the highest specific binding to Vg. Altogether, we concluded that the unique CTL named FmLdlr existed in F. merguiensis might contributed in the shrimp immune response against invading pathogens and its LDLR domain exhibited the potent binding to Vg that might function as a Vg receptor to transport this protein in the hemolymph. เลคติน (lectin) เป็นโปรตีนในกลุ่ม pattern recognition proteins (PRPs) ที่ สําคัญชนิดหนึ่งในสิ่งมีชีวิตซึ่งมีความเกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีวภาพหลายอย่าง เช่น การ ขนส่งโปรตีน (protein trafficking) การสื่อสารของเซลล์ (cell signaling) และการจดจําเชื้อก่อ โรค (pathogen recognition) เป็นต้น โปรตีนชนิดนี้จึงพบได้โดยทั่วไปในสิ่งมีชีวิตเกือบทุกชนิด ความโดดเด่นของเลคตินคือ มีความสามารถในการจับกับโมเลกุลของคาร์โบไฮเดรตบนผิวเซลล์ ชนิดต่าง ๆ อย่างจําเพาะเจาะจง เนื่องจากภายในโมเลกุลของโปรตีนเลคตินมีโดเมนที่สามารถ จดจําโมเลกุลของน้ําตาลหรือคาร์โบไฮเดรตเรียกว่า carbohydrate recognition domain (CRD) CRD ในโปรตีนเลคตินมีหลากหลายชนิด แต่ละชนิดจะมีรูปแบบการจับจําเพาะกับชนิดของ คาร์โบไฮเดรตที่แตกต่างกันออกไป เลคตินที่มีรายงานส่วนใหญ่เป็นเลคตินแบบ C (C-type lectins, CTLs) ซึ่งต้องการ Ca” ในการทํางานเพื่อตอบสนองด้านภูมิคุ้มกันหลังจากโมเลกุล ของโปรตีนชนิดนี้จับกับน้ําตาลบนผิวเซลล์ของเชื้อก่อโรค จากผลการศึกษาไม่นานนี้พบว่า CTLs ที่มี CRD และโดเมน low-density lipoprotein receptor (LDLR) class A ในกุ้งขาว (Litopenaeus vannamel) มีส่วนร่วมในระบบภูมิคุ้มกันในการป้องกันไวรัสหัวเหลือง (yellow head virus) โดยผ่านทางการกระตุ้นระบบโปรฟีนอลออกซิเดส และยังมีงานวิจัยที่พบว่า CTLs ที่มีโดเมน LDLR ซึ่งมีชื่อว่า LdlrLec1 และ LdlrLec2 ในกุ้งคุรุมา (Marsupenaeus japonicus) ทําหน้าที่ในการตอบสนองหรือยับยั้งการติดเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาว (white spot syndrome virus, wSsv) ในกุ้ง จากข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า CTLs ที่มีโดเมน CRD ร่วมกับการมีโดเมน LDLR เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกันและการตอบสนองต่อเชื้อไวรัสในกุ้ง งานวิทยานิพนธ์นี้จึง สนใจโคลนยืนและศึกษาสมบัติระดับโมเลกุลของยืน CTL ที่มีโดเมน LDLR จากฮีโมไซท์ของกุ้ง แชบ๊วยโดยให้ชื่อว่า FmLdlr ซึ่งยังไม่เคยมีการศึกษามาก่อน อาทิ การศึกษาสมบัติของยืน FmLdlr สายเต็ม ศึกษาการแสดงออกของยืนชนิดนี้ในเนื้อเยื่อต่าง ๆ ของกุ้งแชบ๊วย และศึกษา บทบาทและความสําคัญของยีนชนิดนี้ โดยศึกษาผลของการยับยั้งการแสดงออกของยีนดังกล่าว โดยวิธี RNA interference ในกุ้งแชบ๊วย รวมทั้งผลิตโปรตีนลูกผสม (recombinant protein) จากยืน FmLdlr สายเต็ม (FFmLdlr) จากโดเมน CRD (rCRD) และโดเมน LDLR (rLDLR) เพื่อ ศึกษาบทบาทของโปรตีนเลคตินทั้งโมเลกุลและแต่ละโดเมนต่อเชื้อก่อโรคและเพื่อความเข้าใจใน ระบบภูมิคุ้มกันหรือการตอบสนองต่อเชื้อก่อโรคในกุ้งแชบ๊วยมากขึ้น นอกจากนี้ จากการศึกษา ก่อนหน้านี้ เกี่ยวกับ vitellogenin ซึ่งเป็นโปรตีนตั้งต้นในการสร้างโปรตีน yolk ในกระบวนการ สร้างไข่ (oogenesis) ในกุ้งตัวเมียพบว่า การขนส่ง vitellogenin จาก hepatopancreas ซึ่งเป็น อวัยวะสร้างไปยัง ovary ซึ่งเป็นอวัยวะเป้าหมาย ผ่านทาง hemolymph ต้องอาศัย receptor ซึ่ง พบว่า receptor ที่ทําหน้าที่นี้อยู่ในกลุ่ม LDLR family ซึ่งเป็นกลุ่มโปรตีนที่มีหน้าที่หลากหลาย และพบได้ในหลากหลายอวัยวะ จึงเป็นที่น่าสนใจอย่างยิ่งที่จะศึกษาหน้าที่ของโดเมน LDLR ภายในโมเลกุลของเลคติน FmLdlr ชนิดที่กําลังสนใจศึกษาว่าสามารถจับกับ vitellogenin ได้ หรือไม่ งานวิทยานิพนธ์นี้สามารถโคลนยืน CTL ที่มีโดเมน LDLR ได้สําเร็จจากฮีโม ไซท์ของกุ้งแชบ๊วย cDNA สายเต็มของยืน FmLdlr มีขนาด1,425 คู่เบส ประกอบด้วย 5 untranslated region (5"UTR) 100 คู่เบส, 3 untranslated region (3UTR) 410 คู่เบส และ open reading frame (ORF) 915 คู่เบส แปลรหัสเป็นเปปไทต์ยาว 305 กรดอะมิโน มีมวล โมเลกุล 31.78 กิโลดัลตัน ภายในโครงสร้างเปปไทด์ มี signal peptide ยาว 20 กรดอะมิโน มี ค่า pl เป็น 5 ลําดับกรดอะมิโนของ FmLdlr มีความเหมือนกับ LiirLec1 จาก M. japonicus (89%) โครงสร้างปฐมภูมิของ FmLdlr ประกอบด้วยโดเมน LDLR ที่บริเวณ N-terminus และ โดเมน CRD ซึ่งมี OAP motif ที่บริเวณ C-terminus ยืน FmLdlr พบการแสดงออกในฮีโมไซท์ เพียงอย่างเดียว ไม่พบในอวัยวะอื่น และพบการแสดงออกของยีน FmLdlr เพิ่มขึ้นอย่างมี นัยสําคัญหลังการฉีดกุ้งด้วยเชื้อ Vibrio parahaemolyticus และ Wssv โดยมีรูปแบบการ แสดงออกที่แตกต่างกันในแต่ละช่วงเวลา การ knockdown ยืน FmLdlr ในกุ้งแชบ๊วยด้วย FmLdlr dsRNA มีผลทําให้การแสดงออกของยืน FmLdlr ลดลงอย่างมากถึง 90% และเมื่อ knockdown กุ้งแชบ๊วย ร่วมกับการฉีดเชื้อก่อโรคมีผลทําให้ลดครึ่งเวลาการรอดและเพิ่มอัตรา การตายสะสมของกุ้ง โปรตีนลูกผสมของ FmLdlr (rFmLdlr) และ 2 โดเมนคือ rCRD และ rLDLR ถูกผลิตโดยระบบแบคทีเรียและถูกนําไปใช้ในงานวิทยานิพนธ์เพื่ออธิบายลักษณะการ ทํางานของเลคตินชนิดนี้ โปรตีนลูกผสมของเลคติน FmLdlr ทั้งสามชนิดสามารถเหนี่ยวนําให้ เกิดการเกาะกลุ่ม (agglutination) ของแบคทีเรียที่ใช้ทดสอบได้ทั้งชนิดแกรมบวก (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus) แ ล ะ แ ก ร ม ล บ (Vibrio harvei, v. parahaemolyticus, Escherichia coli, Salmonella typhi) ในสภาวะที่ต้องการแคลเซียมโดย TFmLdlr สามารถเหนี่ยวนําได้ดีที่สุด รองมาคือ rCRD และ rLDLR นอกจากนี้ยังพบว่าโปรตีน ลูกผสมทั้งสามชนิดมีฤทธิ์ทําให้เชื้อ V. parahaemolyticus เกิดการเกาะกลุ่มได้ดีที่สุด ใน การศึกษาความสามารถในการกลืนกิน (phagocytosis) ของเซลล์ฮีโมไซท์ พบว่า rFmLdlr และ rCRD เหนี่ยวนําให้ฮีโมไซท์ของกุ้งสามารถกลืนกินเชื้อแบคทีเรีย V. parahaemolyticus เพิ่มขึ้น แต่ไม่พบการกระตุ้นโดย rLDLR นอกจากนี้ rFmLdlr และ rCRD ยังมีผลกระตุ้นให้เกิด กระบวนการกักล้อมเชื้อโรค (encapsulation) ของฮีโมไซท์กุ้งเพิ่มขึ้นอีกด้วย จากการทํา in vivo clearance test ทําให้ทราบว่าโปรตีนลูกผสมของเลคตินทั้งสามชนิด มีส่วนช่วยให้การกําจัดเชื้อ แบคทีเรียภายในตัวกุ้ง โดย rFmLdlr มีฤทธิ์ในการกําจัดเชื้อ V. parahaemolyticus ดีที่สุด รอง มาคือ rCRD และ FLDLR ตามลําดับ นอกจากนี้ยังพบว่าโปรตีนลูกผสมทั้งสามชนิดมีฤทธิ์ยับยั้ง การเจริญเติบโตของเชื้อ V. parahaemolyticus โดย rFmLdlr มีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อสูงสุด รองลงมา ตามลําดับคือ rCRD และ rLDLR เมื่อเทียบกับชุดควบคุม การทดสอบด้วยวิธี ELISA ทําให้ ทราบว่าโปรตีนลูกผสม rFmLdlr และ rCRD สามารถจับกับโปรตีนลูกผสมที่เป็นส่วนประกอบ ของ WSSV คือ VP15, VP28 และ VP39A ซึ่ง rFmLdlr มีความจําเพาะและจับกับโปรตีน ลูกผสมของไวรัสทั้งสามชนิดได้ดีกว่า rCRD แต่ rLDLR ไม่สามารถจับกับโปรตีนที่เป็น ส่วนประกอบของ Wssv ได้ เป็นที่น่าสนใจอย่างยิ่งเมื่อนํา rFmLdlr, rCRD และ rLDLR มา ทดสอบการจับกับโปรตีน vitellogenin บริสุทธิ์ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของกระบวนการสร้างไข่ในกุ้ง ด้วยวิธี ELISA พบว่า โปรตีนลูกผสมของเลคตินทั้งสามชนิดสามารถจับกับ viteliogenin ได้และ FLDLR มีความจําเพาะในการจับกับ vitellogenin มากที่สุด จากงานวิทยานิพนธ์นี้สรุปได้ว่า FmLdlr เป็น CTL ชนิดใหม่ที่พบใน F. merguiensis ซึ่งเกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกันของกุ้งต่อ เชื้อก่อโรคบุกรุก และโดเมน LDLR ซึ่งสามารถจับกับ vitelogenin ได้ดี อาจทําหน้าที่เป็น vitelogenin receptor ในการขนส่ง vitellogenin ผ่าน hemolymph 2024-06-19T03:31:12Z 2024-06-19T03:31:12Z 2019 Thesis http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/19485 en Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Thailand http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/th/ application/pdf Prince of Songkla University |