การตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง C580Y ของยีน Kelch13 Propeller ที่มีความสัมพันธ์กับการดื้อยาอาร์ทิมิซินินในเชื้อ Plasmodium falciparum โดยวิธี Loop - Mediated Isothermal Amplification
วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต (จุลชีววิทยา), 2562
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | Theses and Dissertations |
| Language: | Thai |
| Published: |
มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์
2024
|
| Subjects: | |
| Online Access: | http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/19534 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Institution: | Prince of Songkhla University |
| Language: | Thai |
| id |
th-psu.2016-19534 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
Prince of Songkhla University |
| building |
Khunying Long Athakravi Sunthorn Learning Resources Center |
| continent |
Asia |
| country |
Thailand Thailand |
| content_provider |
Khunying Long Athakravi Sunthorn Learning Resources Center |
| collection |
PSU Knowledge Bank |
| language |
Thai |
| topic |
มาลาเรียดื้อยา การดื้อยา |
| spellingShingle |
มาลาเรียดื้อยา การดื้อยา ธัญชนก คำมณี การตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง C580Y ของยีน Kelch13 Propeller ที่มีความสัมพันธ์กับการดื้อยาอาร์ทิมิซินินในเชื้อ Plasmodium falciparum โดยวิธี Loop - Mediated Isothermal Amplification |
| description |
วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต (จุลชีววิทยา), 2562 |
| author2 |
นงเยาว์ สว่างเจริญ |
| author_facet |
นงเยาว์ สว่างเจริญ ธัญชนก คำมณี |
| format |
Theses and Dissertations |
| author |
ธัญชนก คำมณี |
| author_sort |
ธัญชนก คำมณี |
| title |
การตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง C580Y ของยีน Kelch13 Propeller ที่มีความสัมพันธ์กับการดื้อยาอาร์ทิมิซินินในเชื้อ Plasmodium falciparum โดยวิธี Loop - Mediated Isothermal Amplification |
| title_short |
การตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง C580Y ของยีน Kelch13 Propeller ที่มีความสัมพันธ์กับการดื้อยาอาร์ทิมิซินินในเชื้อ Plasmodium falciparum โดยวิธี Loop - Mediated Isothermal Amplification |
| title_full |
การตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง C580Y ของยีน Kelch13 Propeller ที่มีความสัมพันธ์กับการดื้อยาอาร์ทิมิซินินในเชื้อ Plasmodium falciparum โดยวิธี Loop - Mediated Isothermal Amplification |
| title_fullStr |
การตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง C580Y ของยีน Kelch13 Propeller ที่มีความสัมพันธ์กับการดื้อยาอาร์ทิมิซินินในเชื้อ Plasmodium falciparum โดยวิธี Loop - Mediated Isothermal Amplification |
| title_full_unstemmed |
การตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง C580Y ของยีน Kelch13 Propeller ที่มีความสัมพันธ์กับการดื้อยาอาร์ทิมิซินินในเชื้อ Plasmodium falciparum โดยวิธี Loop - Mediated Isothermal Amplification |
| title_sort |
การตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง c580y ของยีน kelch13 propeller ที่มีความสัมพันธ์กับการดื้อยาอาร์ทิมิซินินในเชื้อ plasmodium falciparum โดยวิธี loop - mediated isothermal amplification |
| publisher |
มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์ |
| publishDate |
2024 |
| url |
http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/19534 |
| _version_ |
1806509632182550528 |
| spelling |
th-psu.2016-195342024-07-09T04:05:14Z การตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง C580Y ของยีน Kelch13 Propeller ที่มีความสัมพันธ์กับการดื้อยาอาร์ทิมิซินินในเชื้อ Plasmodium falciparum โดยวิธี Loop - Mediated Isothermal Amplification Detection of C580Y Mutation in Kelch13 Propeller Gene Associated with Artemisinin Resistance in Plasmodium falciparum Using Loop - Mediated Isothermal Amplification Method ธัญชนก คำมณี นงเยาว์ สว่างเจริญ Faculty of Science (Microbiology) คณะวิทยาศาสตร์ ภาควิชาจุลชีววิทยา มาลาเรียดื้อยา การดื้อยา วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต (จุลชีววิทยา), 2562 Plasmodium falciparum resistance to artemisinin based combination therapies in Southeast Asia become a major obstacle for malaria control and elimination efforts. This could be more critical if it spreading to Africa, where plenty of people are infected with malaria. The important factor is limit the spreading of drug resistance malaria. The artemisinin resistance is related to the mutations of the Pfkelch13 gene, especially at the C580Y position. This point mutation is the most widespread in Southeast Asia, including Thailand. Accordingly, the employment of effective molecular biology techniques is one method that can be used for surveillance and monitoring of drug resistance. This study therefore developed SNP-loop-mediated isothermal amplification (SNP-LAMP) to detect C580Y mutation. A set of primers specific for Pfkelch13 C580Y gene were designed and the LAMP reaction conditions and concentration of reagent were optimized by using a plasmid containing the Pfkelch13 C580Y gene as positive control. It was found that the best LAMP reaction conditions were at 56°C 45 minutes and a concentration of 5 mM MgSO4, 0.8 mM dNTPs, 8 U Bst DNA polymerase and 1 M betaine. A positive reaction is designated when the color of hydroxynapthol blue (HNB) change from purple to sky blue when view with naked eye. The products confirmed by gel electrophoresis showed ladder like pattern bands. The LAMP primers were specifically distinguished only the C580Y mutation. No cross reactivity was observed with other Plasmodium spp., human DNA or Pfkelch13 wild type and Pfkelch13 P574L gene. LAMP reaction was able to detect as low as 50 copies of plasmid per reaction, The sensitivity is 10-fold higher than conventional PCR method. A total of 120 dried blood spots from patients were analyzed. The LAMP assay successfully differentiate positive samples containing Pfkelch13 C580Y gene from wild type. The detection limit of LAMP assay is 335 parasites/μl. Sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV) showed all 100% along with good repeatability and reproducibility to detect C580Y mutation. Therefore, this technique has the advantages of rapidity, simplicity, sensitivity, specificity and could be used as a clinical diagnosis tool in field testing as well as surveillance of artemisinin resistance. ทุนผู้ช่วยวิจัยคณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์, ทุนอุดหนุนการวิจัยเพื่อวิทยานิพนธ์ เชื้อมาลาเรียชนิด Plasmodium falciparum ดื้อต่อกลุ่มยาอาร์ทิมิชินินในภูมิภาค เอเชียตะวันออกเฉียงใต้เป็นอุปสรรคสําคัญในการควบคุมและการกําจัดเชื้อมาลาเรียให้หมดไป และจะ วิกฤตมากขึ้นหากเชื้อดื้อยาแพร่ระบาดไปยังแอฟริกาซึ่งมีผู้ติดเชื้อมาลาเรียเป็นจํานวนมาก ปัจจัยสําคัญ คือต้องจํากัดการแพร่ระบาดของเชื้อดื้อยาไม่ให้ขยายวงกว้างออกไป การดื้อยาอาร์ทิมิชินินเกี่ยวข้องกับ การกลายพันธุ์ของยีน Pfkelch13 โดยเฉพาะที่ตําแหน่ง C580Y พบมากที่สุดในเอเชียตะวันออกเฉียง ใต้รวมถึงประเทศไทย ดังนั้นการใช้เทคนิคทางอณูชีววิทยาที่มีประสิทธิภาพเป็นวิธีการหนึ่งที่สามารถใช้ ในการเฝ้าระวังและติดตามการดื้อยา จึงได้พัฒนาเทคนิค SNP-loop-mediated isothermal amplification (SNP-LAMP) เพื่อตรวจหาการดื้อยาของยีน Pikelch13 C580Y ได้อย่างรวดเร็ว โดย ออกแบบชุด primer ให้มีความจําเพาะต่อยืน Pfkelch13 C580Y ศึกษาหาสภาวะการทํางานและ ความเข้มข้นของสารที่เหมาะสมในปฏิกิริยาโดยใช้พลาสมิดที่มีชิ้นยีน Pfkelch13 C580Y เป็น positive control พบว่าสภาวะที่เหมาะสมในการตรวจสอบยีนคือที่อุณหภูมิ 56°C โดยใช้เวลา 45 นาที ที่ความเข้มข้น 5 mM MgSO4, 0.8 mM dNTPs, 8 U Bst DNA polymerase และ 1 M betaine ทําให้ในปฏิกิริยาผลบวกเห็นการเปลี่ยนแปลงของสี hydroxynapthol blue (HNB) จากสีม่วงเป็นสีฟ้า ได้ด้วยตาเปล่า เมื่อยืนยันผลการทดสอบด้วยวิธี gel electrophoresis จะปรากฏ ladder like pattern bands และเมื่อทดสอบหาความจําเพาะและความไว พบว่า primer ชุดนี้มีความจําเพาะต่อ Pketch13 C580Y เท่านั้น ไม่เกิดปฏิกิริยากับเชื้อ Plasmodium spp. อื่น, DNA มนุษย์, ยืน Pfkelch13 wild type และ Pfkelch13 ที่มีตําแหน่งกลายพันธุ์ P574L สามารถตรวจสอบการกลาย พันธุ์ได้ที่ความเข้มข้นต่ําสุด 50 copies ซึ่งมีความไวมากกว่าวิธี PCR 10 เท่า เมื่อนําเอาเทคนิค SNP- LAMP มาประยุกต์ใช้กับ genomic DNA ที่สกัดจากจุดเลือดแห้งของผู้ป่วยจํานวน 120 ตัวอย่าง พบว่า ตัวอย่างที่มียีน Pikelch13 C580Y สามารถตรวจสอบได้ที่ปริมาณเชื้อต่ําสุด 335 parasites/ul และไม่ให้ผลบวกกับ genomic DNA ของ Pikelch13 wild type และ P. vivax เมื่อเปรียบเทียบ เทคนิค LAMP กับ DNA sequencing ซึ่งใช้เป็นวิธีมาตรฐานพบว่าเทคนิค LAMP มีค่าความไว ความจําเพาะ ค่าทํานายผลบวกและค่าทํานายผลลบเป็นร้อยละ 100 ทั้งหมด และมีความสามารถใน การทําซ้ํา ความสามารถในการทําเหมือน ดังนั้นเทคนิค SNP-LAMP ที่พัฒนาขึ้นเป็นเทคนิคที่มี ความจําเพาะต่อการตรวจสอบ Pikelch13 C580Y และง่ายต่อการใช้งาน จึงสามารถใช้เป็นเครื่องมือ ในการวินิจฉัยและประเมินการดื้อยาอาร์ทิมิชินินในพื้นที่ระบาดของมาลาเรียได 2024-07-09T04:05:14Z 2024-07-09T04:05:14Z 2019 Thesis http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/19534 th Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Thailand http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/th/ application/pdf มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์ |