Screening of spore forming d-lactic acid producing bacteria and its optimization

• Main Author: Budsabathip Prasirtsak
• Other Authors: Nuttha Thongchul
• Format: Theses and Dissertations
• Language: English
• Published: Chulalongkorn University 2017
• Online Access: https://digiverse.chula.ac.th/Info/item/dc:36644
• Institution: Chulalongkorn University

งานวิจัยนี้มุ่งเน้นการคัดแยก คัดกรอง หาภาวะเหมาะสม รวมถึงการแสดงออกของเอนไซม์ที่สำคัญที่เกี่ยวกับการผลิตกรดดีแล็กติกสำหรับแบคทีเรียสายพันธุ์ใหม่ที่คัดเลือกได้โดยให้ค่า ผลผลิต อัตราการผลิต และค่าความบริสุทธิ์เชิงแสงของกรดดีแล็กติกที่สูง ผลจากการคัดกรองพบว่า NK26-11T เป็นแบคทีเรียสายพันธุ์ใหม่ แบคทีเรียแกรมบวก สร้างคะตะเลส เจริญได้ทั้งภาวะมีและไม่มีอากาศ สร้างสปอร์ที่รูปร่างทรงแท่ง ที่คัดแยกได้จากดินในประเทศไทย สายพันธุ์นี้สามารถผลิตกรดดีแล็กติกจากกลูโคสแบบโฮโมเฟอร์เมนเททีฟ เจริญที่อุณหภูมิ 20-45 องศาเซลเซียส และพีเอช 5-8.5 ผนังเซลล์มี meso-diaminopimelic acid เป็นองค์ประกอบของเพปทิโดไกลแคน ในกระบวนการหายใจประกอบด้วยเมนาควิโนนชนิด 7 เป็นองค์ประกอบหลัก ดีเอนเอมีองค์ประกอบของกัวนีนกับไซโตซีนหลัก 42.6 เปอร์เซ็นต์โมล และองค์ประกอบกรดไขมันหลักแบบ anteiso-C15:0 และ anteiso-C17:0 ผลจากการวิเคราะห์ลําดับเบสในช่วง 16S rRNA gene พบว่าสายพันธุ์ NK26-11T มีความสัมพันธ์ใกล้เคียง Bacillus solimangrovi JCM 18994T (93.89 เปอร์เซ็นต์) Pullulanibacillus naganoensis LMG 12887T (93.32 เปอร์เซ็นต์) Sporolactobacillus inulinus NRIC 1133T (92.99 เปอร์เซ็นต์) Tuberibacillus calidus JCM 13397T (92.98 เปอร์เซ็นต์) และ Thalassobacillus devorans DSM 16966T (น้อยกว่า 90.93 เปอร์เซ็นต์) สายพันธุ์ NK26-11T เป็นแบคทีเรียสกุลใหม่ที่เป็นตัวแทนระหว่างสกุล Bacillus และ Sporolactobacillus จึงได้เสนอ Terrilactibacillus laevilacticus เป็นแบคทีเรียสกุลใหม่โดยมี NK26-11T เป็นตัวแทนของสกุลและสปีชีส์ (=LMG 27803T =TISTR 2241T =PCU 335T) ผลจากการคัดกรองแบคทีเรียที่ผลิตกรดดีแล็กติกพบว่า Terrilactibacillus laevilacticus SK5-6 มีประสิทธิภาพในการผลิตกรดดีแล็กติก (กรดแล็กติกสุดท้าย 99.27 กรัมต่อลิตร ผลผลิต 0.90 กรัมของกรดดีแล็กติกต่อกรัมของกลูโคสที่ใช้ไป อัตราการผลิต 1.38 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง และค่าความบริสุทธิ์เชิงแสงของกรดดีแล็กติก 99.00 เปอร์เซ็นต์) มากกว่าสปีชีส์ Sporolactobacillus และ Terrilactibacillus ไอโซเลทนี้สามารถผลิตกรดดีแล็กติกจากแหล่งน้ำตาลที่หลากหลาย ซึ่งตรงข้ามกับสายพันธุ์ Sporolactobacillus ซึ่งเป็นแบคทีเรียที่ผลิตกรดดีแล็กติกและไม่ผลิตคะตะเลส จากคุณลักษณะของ T. laevilacticus SK5-6 ที่ผลิตคะตะเลสได้จึงแบ่งการทดลองเป็นสองขั้นตอนสำหรับการผลิตกรดดีแล็กติก ขั้นตอนการเลี้ยงหัวเชื้อบ่มในภาวะมีอากาศส่งผลให้ได้มวลเซลล์ปริมาณมากในระยะเวลาที่สั้น การเตรียมหัวเชื้อในระยะที่เหมาะสม (อายุหัวเชื้อ) และความเข้มข้นมวลเซลล์ (ปริมาณหัวเชื้อ) ถ่ายเทสู่กระบวนการหมัก พบว่าสายพันธุ์ SK5-6 สามารถใช้กลูโคสเปลี่ยนเป็นกรดดีแล็กติกได้อย่างรวดเร็วภายใต้ภาวะไร้อากาศส่งผลให้ได้กรดดีแล็กติกสุดท้ายในปริมาณที่สูง (102.22 กรัมต่อลิตร) ผลผลิต (0.84 กรัมต่อกรัม) อัตราการผลิต (2.13 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง) และไม่เกิดผลิตภัณฑ์ข้างเคียง นอกจากนี้ยังพบว่าสายพันธุ์ SK5-6 แสดงผลจลนพลศาสตร์ของการหมัก และการแสดงออกของเอนไซม์มากกว่า S. laevilacticus ซึ่งเป็นแบคทีเรียผลิตกรดดีแล็กติกที่ไม่สร้างคะตะเลส ฟอสโฟฟรุกโตไคเนสแสดงกิจกรรมของเอนไซม์ในปริมาณที่ต่ำซึ่งเกี่ยวข้องกับวิถีไกลโคไลซิสส่งผลต่ออัตราการผลิตกรดดีแล็กติกของสายพันธุ์ SK5-6 ในระหว่างกระบวนการหมักกรดแล็กติกพบว่าเมื่อพีเอชเพิ่มขึ้นส่งผลกระตุ้นการทำงานของดีแล็กเทตดีไฮโดรจีเนส มากกว่าแอลแล็กเทตดีไฮโดรจีเนส ส่งผลให้ค่าความบริสุทธิ์เชิงแสงของกรดดีแล็กติกสูงขึ้น ในขณะที่พีเอชค่าความเป็นกรดส่งผลต่อการทำงานของไคเนสในวิถีไกลโคไลซิส การเกิดไอโซเมอร์ไรเซชั่นจากการเปลี่ยนกรดแอลแล็กเทตเป็นกรดดีแล็กเทตโดยไอโซเมอเรส สามารถพบในระหว่างการหมักกรดแล็กติก จากการศึกษาครั้งนี้พบว่าคุณลักษณะที่โดดเด่นของสายพันธุ์ SK5-6 โดยเฉพาะผลผลิตที่สูง และไม่เกิดผลิตภัณฑ์ข้างเคียง จากคุณลักษณะที่สำคัญสามารถกล่าวได้ว่าเป็นแบคทีเรียที่เหมาะสมกับอุตสาหกรรมการหมักกรดดีแล็กติก