MUTANT CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF GENE ENCODING ?-AMYLASE BMAN2 W198F AND W198A IN _ESCHERIECHIA COLI_

• Main Author: ELVIA DWIFITRIAYU, RERE
• Format: Final Project
• Language: Indonesia
• Online Access: https://digilib.itb.ac.id/gdl/view/30331
• Institution: Institut Teknologi Bandung

a-Amilase (E.C.3.2.1.1) merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis pada ikatan <br /> <br /> a-1,4-glikosidik pada pati menghasilkan oligosakarida linier dan bercabang. a-Amilase <br /> <br /> BmaN2, dari Bacillus megaterium NL3 berasal dari Danau Kakaban, Kalimantan Timur, <br /> <br /> dapat mendegradasi pati mentah meskipun tidak memiliki domain pengikat pati (SBD). <br /> <br /> Residu Trp198 diperkirakan berpotensi sebagai starch binding slre (SBS), yang membanlu <br /> <br /> BmaN2 dalam menghidrolisis pati. Tujuan penelitian ini adalah mengkonstruksi mutan gen <br /> <br /> bmaN2 W198F dan W198A untuk mempelajari peran Trp198 dalam hidrolisis pati. Mutasi <br /> <br /> dilakukan pada kodon TGG di posisi 592, 593, dan 594 yang mengkode Trp198 dengan <br /> <br /> substitusi menjadi I-tC dan GCG agar mengkode Phe198 (W198D dan Ala198 (W198A). <br /> <br /> Mutasi telah berhasil dilakukan berdasarkan penentuan urutan nukleotida. Ekspresi bmaN2 <br /> <br /> wild type, bmaN2 W198F, dan bmaN2 W198A dilakukan pada sel inang E.coli <br /> <br /> ArcticExpress (DE3) yang diinduksi IPTG 0,5 M selama 24 jam pada suhu 15'C. Analisis <br /> <br /> SDS-PAGE menunjukkan BmaN2 wild type, BmaN2 Wl98F, dan BmaN2 W198A memiliki <br /> <br /> ukuran sebesar -61,5 kDa. Penentuan aktivitas a-amilase dilakukan dengan metode DNS <br /> <br /> berdasarkan jumlah gula pereduksi pada suhu 40"C dan pH 8 selama 10 menit. Aktivitas <br /> <br /> spesifik masing - masing dari BmaN2 wild type, Bmar2 W198F, dan BmaN2 W198A <br /> <br /> adalah 22,3 Ulmg; 17,0 U/mg; dan 13,3 U/mg. Derajat hidrolisis pati mentah pada BmaN2 <br /> <br /> wild type terhadap beras, gandum, ganyong, jagung, kentang, singkong, dan sagu masingmasing <br /> <br /> adalah l6,53oh 25,33o/a, l4,4lyo, I3,82Ya,7,94o/o, 14,89ya, datn I6,7Yo. Derajat <br /> <br /> hidrolisis mutan BmaN2 W19SF pada masing-masing sribstrat adalah 14,62yo, 25,24yo, <br /> <br /> 13,48oh, 13,33yo,7,37yo, l2,93yq dan 14,90o/o. Derajat hi&olisis mutan BmaN2 W1984 <br /> <br /> pada masing-masing substrat adalah 12,83Yq21,94yo, 11,99y", 12,86yo,7,A3yo, 11"107o, dan <br /> <br /> 13,73Y".