KARAKTERISASI ENZIMATIK MUTEIN REKOMBINAN SIKLODEKSTRIN GLIKOSILTRANSFERASE 1147K DENGAN PATI SAGU SEBAGAI SUBSTRAT

• Main Author: David
• Format: Final Project
• Language: Indonesia
• Online Access: https://digilib.itb.ac.id/gdl/view/64336
• Institution: Institut Teknologi Bandung

Siklodekstrin glikosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) adalah enzim yang memproduksi siklodekstrin dari pati. Dalam penelitian ini, dilakukan pengamatan efek substitusi residu 47 pada beberapa karakteristik enzim CGTase. Gen cgtase mutan H47K dikonstruksi dari gen cgtase WT sintetik dari Bacillus sp. A2-5a yang kodonnya sudah dioptimasi untuk diekpresikan di Escherichia coli BE21(DE3). Enzim rCGTase H47K diproduksi di E. coli BL21(DE3) dengan induksi IPTG 0,1 mM selama 24 jam pada 27 °C. Enzim rCGTase H47K terlarut kemudian dimumikan dengan resin Ni-NTA. Enzim rCGTase H47K yang dihasilkan memiliki perolehan kembali sebesar 79,38% dan derajat purilikasi sebesar 14,7 kali terhadap protein total sitoplasmik. Aktivitas enzimatik spesifik rCGTase H47K adalah 12,05 U/mg. Aktivitas dan hidrolisis pati diamati melalui zimografi dengan pewarnaan fenolftalein dan larutan 12/K1 sebagai indikator warna. Kuanti?kasi CD-13 yang dikatalisis enzim dilakukan dengan spektrofotometer pada 550 nm dengan fenolftalein sebagai indikator warna. Suhu clan pH optimum untuk memproduksi berturut-turut adalah 60 °C dan 7. Enzim ini dapat mempertahankan setengah aktivitasnya pada suhu 63,63 °C dan stabil pada rentang pH yang lugs yakni 5,3-9,7. Rasio produk siklisasi rCGTase H47K yang dihasilkan untuk CD-a: -y adalah 0 : 63 : 37 pada waktu inkubasi 5 jam dan 12 : 70 : 8 pada waktu inkubasi 24 jam. Karakter ini diamati dengan KCKT menggunakan kolom NH? dan detekor indeks refraksi. Fase gerak yang digunakan adalah air : asetonitril (30 : 70) dengan laju aliran 1 rnL.min 1. Pati jagung, singkong termoditikasi, sagu, kentang terlarut, tapioka, dan tepung terigu diujikan pada media Horikoshi untuk menentukan rentang substrat rCGTase 1147K. Enzim rCGTase H47K memprinyai produk CD-13 tertinggi dengan substrat pati sagu tergelatinasi. Parameter kinetika rCGIase H47K dengan pati sagu tergelatinasi ditentukan pada kondisi optimum. Parameter kinetika enzim (Vmax, Km, Kcat, dan Eff) rCGTase 1147K dalani memproduksi CD-13 menggunakan substrat pati sagu secara beurutan atfalah 8,7x10-4 mg.mLimenit-1, 39,74 ag.m1:1, 0,22 menifi, dan 249,63. Pada penelitian ini, diraporkan pergeseran jenis produk rCGTase H47K dari CD-I3 menjadi CD-y pada waktu inkubasi 5 jam dan pergeseran dari CD-(3/y menjadi CD-a pada waktu inkubasi 24 jam