The active site of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus sp. A11
Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 1998
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | Theses and Dissertations |
| Language: | English |
| Published: |
Chulalongkorn University
2009
|
| Subjects: | |
| Online Access: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/9494 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Institution: | Chulalongkorn University |
| Language: | English |
| id |
th-cuir.9494 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
Chulalongkorn University |
| building |
Chulalongkorn University Library |
| country |
Thailand |
| collection |
Chulalongkorn University Intellectual Repository |
| language |
English |
| topic |
Cyclodextin glycosyltransferase Bacillus sp. A11 Amino acids Enzymes |
| spellingShingle |
Cyclodextin glycosyltransferase Bacillus sp. A11 Amino acids Enzymes Anchalee Tongsima The active site of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus sp. A11 |
| description |
Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 1998 |
| author2 |
Piamsook Pongsawasdi |
| author_facet |
Piamsook Pongsawasdi Anchalee Tongsima |
| format |
Theses and Dissertations |
| author |
Anchalee Tongsima |
| author_sort |
Anchalee Tongsima |
| title |
The active site of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus sp. A11 |
| title_short |
The active site of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus sp. A11 |
| title_full |
The active site of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus sp. A11 |
| title_fullStr |
The active site of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus sp. A11 |
| title_full_unstemmed |
The active site of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus sp. A11 |
| title_sort |
active site of cyclodextrin glycosyltransferase from bacillus sp. a11 |
| publisher |
Chulalongkorn University |
| publishDate |
2009 |
| url |
http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/9494 |
| _version_ |
1681409849257099264 |
| spelling |
th-cuir.94942009-08-03T07:34:00Z The active site of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus sp. A11 บริเวณเร่งของไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจาก Bacillus sp. A11 Anchalee Tongsima Piamsook Pongsawasdi Chulalongkorn University. Graduate School Cyclodextin glycosyltransferase Bacillus sp. A11 Amino acids Enzymes Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 1998 Chemical modification of CGTase from Bacillus sp. A11 was performed under optimized mild conditions. Loss of CGTase activities was observed when modifications were made on carboxyl, histidine, tryptophan, and tyrosine residues by treatment with 1 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), diethylpyrocarbonate (DEP), N-bromosuccinimide (NBS) an dN-acetylimidazole (NAI), respectively. While modification of cysteine, lysine, and serine residues with up to 100 mM concentrations of N-ethylmaleimide (NEM), 2, 4, 6-trinitrobenzenesulfonic acid, and phenylmethylsulfonyl fluoride, respectively did not affect CGTase activities. For cysteine modification, iodoacetamide and dithiothreitol treatment gave the same result as NEM. Protection of the active site of CGTase with protective substance (alpha-, beta-, gamma-CD, or maltotriose) prior to chemical modification significantly reduced activity loss. These results suggested that carboxyl (aspartic and glutamic acids), histidine, tryptophan, and tyrosine residues were located at the active site of CGTase. In the estimation of the number of histidine, tryptophan, and tyrosine residues at the active site of the enzyme using spectrophotometric determination, it was found that beta-CD or gamma-CD protects two histidine residues, one tryptophan residue, and two tyrosine residues of CGTase. This suggests the presence of these amino acid residues at the active site of CGTase. By non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, effect of chemical modification on the enzyme structure was analyzed. The modification of carboxyl groups by EDC resulted in a protein band which moved slower than the unmodified enzyme suggesting that the net negative charges of the enzyme were reduced. Modification of tryptophan by NBS did not change the pattern of protein and activity bands in the gel. When the enzyme was modified by DEP or NAI, faster protein and activity bands were observed. The result suggests that these two reagents induced more net negative charges or structural changes which leads to more exposed negative charges. Analysis by PAGE thus confirms the modification on carboxyl, histidine, tryptophan, and tyrosine residues by EDC, DEP, NBS, and NAI, respectively. When kinetic parameters of CGTase for cyclodextrin substrates were measured, the michaelis constant (Km) values for coupling reaction were 1.55, 1.60, and 1.94 mM and Vmax values were 2.81, 2.50, and 1.40 mumoles/min for beta-CD, maltosyl (G2)-beta-CD, and methyl-beta-CD, respectively. For cyclodextrin degrading activity, the Km values were 3.16, 1.69, 1.42, and 91.63 mM and Vmax values were 58.96, 13.12, 8.61, and 10.69 mumoles/min for alpha-, beta-, gamma-CD, and maltotriose, respectively. The result indicates that beta- and gamma-CD were more suitable for substrate binding site than the smaller molecules, alpha-CD or linear maltotriose. การดัดแปลงทางเคมีในไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรส (CGTase) จาก Bacillus sp. A11 ในภาวะเหมาะสมที่ไม่รุนแรง พบว่า เมื่อดัดแปลงโครงสร้างของกรดอะมิโนกลุ่มคาร์บอกซิลิก ฮิสติดีน ทริปโตเฟน และไทโรซีน ด้วย 1 มิลลิโมลาร์ของ 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), diethylpyrocarbonate (DEP), N-bromosuccinimide (NBS) และ N-acetyl-imidazole (NAI) ตามลำดับมีผลให้แอคติวิตีของ CGTase ลดลงหรือสูญหายไป ส่วนการดัดแปลงกรดอะมิโนซิสเตอีนไลซีน และเซรีน ด้วยความเข้มข้นถึง 100 มิลลิโมลาร์ของ N-ethyl-maleimide (NEM), 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid และ phenylmethylsulfonyl fluoride ตามลำดับ ไม่มีผลต่อแอคติวิตีของเอนไซม์ สำหรับการดัดแปลงซิสเตอีนด้วย iodoacetamide หรือ dithiothreitol ได้ผลเช่นเดียวกับการใช้ NEM เมื่อทำการป้องกันบริเวณเร่งของเอนไซม์ด้วยสับสเตรทคือ alpha-, beta-, gamma-CD หรือ maltotriose ก่อนการดัดแปลงกรดอะมิโนมีผลทำให้การสูญเสียแอคติวิตีของเอนไซม์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญแสดงให้เห็นว่ากรดอะมิโนกลุ่มคาร์บอกซิลิก ฮิสติดีน ทริปโตเฟนและไทโรซีน มีส่วนเกี่ยวข้องอยู่ในบริเวณเร่งของเอนไซม์ ในการศึกษาจำนวนกรดอะมิโนฮิสติดีนทริปโตเฟนและไทโรซีนที่อยู่ในบริเวณเร่งของ CGTase โดยการตรวจวัดด้วยวิธีสเปกโตรโฟโตเมตริพบว่า beta-CD และ gamma-CD สามารถป้องกันกรดอะมิโนฮิสติดีน 2 ตำแหน่ง ทริปโตเฟน 1 ตำแหน่งและไทโรซีน 2 ตำแหน่ง ซึ่งคาดว่ากรดอะมิโนที่ถูกป้องกันเหล่านี้อยู่ในบริเวณเร่งของเอนไซม์ การวิเคราะห์โดยอิเลคโตรโฟเรซิสในสภาวะไม่เสียสภาพเพื่อศึกษาผลของการดัดแปลงทางเคมีที่มีต่อโครงสร้างของเอนไซม์พบว่า การดัดแปลงกรดอะมิโนกลุ่มคาร์บอกซิลิกด้วย EDC จะได้แถบของเอนไซม์ซึ่งเคลื่อนที่ช้ากว่าเอนไซม์ที่ไม่ได้ดัดแปลง แสดงว่าประจุลบสุทธิของเอนไซม์ลดลง ส่วนการดัดแปลงกรดอะมิโนทริปโตเฟนด้วย NBS ได้รูปแบบของแถบโปรตีนและแอคติวิตีเหมือนเดิม แต่เมื่อดัดแปลงกรดอะมิโนฮิสติดีนและไทโรซินด้วย DEP และ NAI ได้แถบของโปรตีนและแอคติวิตีซึ่งเคลื่อนที่ได้เร็วขึ้นแสดงว่าเกิดการเปลี่ยนแปลงของโครงสร้างทำให้ประจุลบมากขึ้นหรือออกมาอยู่บริเวณด้านนอกมากขึ้น การวิเคราะห์ด้วยเทคนิคนี้เป็นการยืนยันว่าการดัดแปลงทางเคมีโดยการใช้สาร EDC, DEP, NBS และ NAI ทำให้เกิดการดัดแปลงที่กรดอะมิโนกลุ่มคาร์บอกซิลิกฮิสติดีน ทริปโตเฟนและไทโรซีน ตามลำดับ จากการศึกษาค่าคงที่ทางจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์ต่อสับสเตรทพบว่า ค่าคงที่ของไมเคลิส (Michaelis constant, Km) ในปฏิกิริยาคู่ควบมีค่าเท่ากับ 1.55ม 1.60 และ 1.94 มิลลิโมลาร์ และมีความเร็วสูงสุด (Vmax) เท่ากับ 2.81, 2.50 และ 1.40 ไมโครโมลต่อนาที เมื่อใช้ beta-CD, maltosyl (G2)-beta-CD และ methyl-beta-CD ตามลำดับ สำหรับปฏิกิริยาการสลายไซโคลเดกซ์ทรินพบว่ามีค่า Km เท่ากับ 3.16, 1.69, 1.42 และ 91.63 มิลลิโมลาร์ และมีความเร็วสูงสุด (Vmax) เท่ากับ 58.96, 13.12, 8.61 และ 10.69 ไมโครโมลต่อนาที เมื่อใช้ alpha-, beta-, gamma-CD, และ maltotriose ตามลำดับ ผลที่ได้แสดงว่า beta- และ gamma-CD มีโครงสร้างเมาะสมสำหรับบริเวณจับกับสับสเตรทมากกว่าโมเลกุลที่เล็กกว่าเช่น alpha-CD หรือ maltotriose 2009-08-03T07:00:44Z 2009-08-03T07:00:44Z 1998 Thesis 9743315122 http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/9494 en Chulalongkorn University 957184 bytes 1197605 bytes 1035939 bytes 1338036 bytes 1231614 bytes 713020 bytes 1051604 bytes application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf application/pdf Chulalongkorn University |