Molecular Approaches for Microbial Diversity, Screening, Characterization of Bacteriocin Producing Lactic Acid Bacteria and Its Application in Fermented Shrimp (Kung-Som) Production
Thesis (Ph.D., Biotechnology)--Prince of Songkla University, 2018
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | Theses and Dissertations |
| Language: | English |
| Published: |
2019
|
| Subjects: | |
| Online Access: | http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/12261 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Institution: | Prince of Songkhla University |
| Language: | English |
| id |
th-psu.2016-12261 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
Prince of Songkhla University |
| building |
Khunying Long Athakravi Sunthorn Learning Resources Center |
| continent |
Asia |
| country |
Thailand Thailand |
| content_provider |
Khunying Long Athakravi Sunthorn Learning Resources Center |
| collection |
PSU Knowledge Bank |
| language |
English |
| topic |
Fermented foods Microbiology Fermented foods Microbiology |
| spellingShingle |
Fermented foods Microbiology Fermented foods Microbiology Sutanate Saelao Molecular Approaches for Microbial Diversity, Screening, Characterization of Bacteriocin Producing Lactic Acid Bacteria and Its Application in Fermented Shrimp (Kung-Som) Production |
| description |
Thesis (Ph.D., Biotechnology)--Prince of Songkla University, 2018 |
| author2 |
Suppasil Maneerat |
| author_facet |
Suppasil Maneerat Sutanate Saelao |
| format |
Theses and Dissertations |
| author |
Sutanate Saelao |
| author_sort |
Sutanate Saelao |
| title |
Molecular Approaches for Microbial Diversity, Screening, Characterization of Bacteriocin Producing Lactic Acid Bacteria and Its Application in Fermented Shrimp (Kung-Som) Production |
| title_short |
Molecular Approaches for Microbial Diversity, Screening, Characterization of Bacteriocin Producing Lactic Acid Bacteria and Its Application in Fermented Shrimp (Kung-Som) Production |
| title_full |
Molecular Approaches for Microbial Diversity, Screening, Characterization of Bacteriocin Producing Lactic Acid Bacteria and Its Application in Fermented Shrimp (Kung-Som) Production |
| title_fullStr |
Molecular Approaches for Microbial Diversity, Screening, Characterization of Bacteriocin Producing Lactic Acid Bacteria and Its Application in Fermented Shrimp (Kung-Som) Production |
| title_full_unstemmed |
Molecular Approaches for Microbial Diversity, Screening, Characterization of Bacteriocin Producing Lactic Acid Bacteria and Its Application in Fermented Shrimp (Kung-Som) Production |
| title_sort |
molecular approaches for microbial diversity, screening, characterization of bacteriocin producing lactic acid bacteria and its application in fermented shrimp (kung-som) production |
| publishDate |
2019 |
| url |
http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/12261 |
| _version_ |
1781416870088278016 |
| spelling |
th-psu.2016-122612023-10-17T07:35:58Z Molecular Approaches for Microbial Diversity, Screening, Characterization of Bacteriocin Producing Lactic Acid Bacteria and Its Application in Fermented Shrimp (Kung-Som) Production การใช้เทคนิคทางชีวโมเลกุลเพื่อศึกษาความหลากหลายของจุลินทรีย์ การคัดเลือก คุณลักษณะของแบคทีเรียแลกติกที่ผลิตแบคเทอริโอซินและการประยุกต์ใช้ในการผลิตกุ้งส้ม Sutanate Saelao Suppasil Maneerat Faculty of Agro-Industry (Industrial Biotechnology) คณะอุตสาหกรรมเกษตร ภาควิชาเทคโนโลยีชีวภาพอุตสาหกรรม Fermented foods Microbiology Fermented foods Microbiology Thesis (Ph.D., Biotechnology)--Prince of Songkla University, 2018 Kung-som is a traditionally Thai fermented shrimp which is popularly consumed and distributed in the southern part of Thailand. It is produced by naturally fermentation of small sea shrimp (Fenneropenaeus merguiensis) mixing with sugar, sea salt and water, resulting in the unique characteristic of flavors and tastes. The aim of this study was to evaluate food safety of kung-som that distributed in local markets and to identify bacterial community of kung-som using polymerase chain reaction- denaturing gel gradient electrophoresis (PCR-DGGE) technique. For microbiological safety, all samples of kung-som did not find the pathogenic bacteria including Escherichia coli, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus and Salmonella sp. The bacterial DGGE profile targeting the V3 region of 16S rRNA gene indicated that the predominant lactic acid bacteria (LAB) belonged to Lactobacillus farciminis, Lb. plantarum, Lactococcus garvieae, Tetragenococcus halophilus and Weissella thailandensis. Additionally, DGGE result presented coagulase-negative staphylococci (CNS) as a minor microflora in kung-som. Our finding suggested that understanding of bacterial community presented in kung-som and providing a theoretical basis to develop the starter cultures for production of kung-som. Presently, bacteriocin-producing LAB have been widely used as an alternative food-perseverative agent replacing the antibiotics in food-industry. Lactococcus lactis KTH0-18 strain isolated from Thai traditional fermented shrimp (kung-som) had ability to produce heat-stable bacteriocin and demonstrated the antagonistic activity against food-borne pathogens and food spoilage bacteria. An inhibitory activity of bacteriocin retained active after treatment with different pHs (2- 11) and temperatures (80-121°C) but was sensitive to some proteolytic enzymes. The growth of S. aureus significantly decreased after 9 h co-cultivation with bacteriocin-producing Lc. lactis KTH0-1S. Moreover, the addition of bacteriocin KTH0-1S to S. aureus cultures resulted in viable cell counts sharply decreased by 2.0 log CFU/ml demonstrating a bactericidal mode of action. After four steps of purification (ammonium sulfate precipitation, reverse phase cartridge (C, Sep-Pak), cation- exchange chromatography, RP-HPLC on C8 column), the purified bacteriocin KTHO- 18 had a molecular mass of 3.346 kDa using mass spectrometry (MS/MS) analysis. Bacteriocin KTH0-1S was identified as nisin Z by using PCR amplification and sequencing. Additionally, nisin Z-producing Lc. lactis KTH0-1S was sensible towards most of studied antibiotics, non-biogenic amines production and did not harbor virulence genes. Our finding concluded that Lc. lactis KTH0-1S presented a high potential to be used as a starter culture for improving a microbiological safety in kung-som. In order to reduce the accumulation of biogenic amines in fermented foods, bacteriocin-producing LAB showing positive effect against biogenic amines formation. Tyramine as biogenic amine is most frequently found in various fermented foods that present toxicological effects on human. It occurred from tyraminogenic bacteria by conversion of tyrosine into tyramine through tyrosine decarboxylase activity. Tyramine production of 20 strains of LAB and CNS isolated from Thai traditional fermented shrimp (kung-som) was investigated by using chromatographic and molecular methods. Among 20 of bacterial strains isolated from kung-som, Enterococcus faecalis 9Y, Ent. faecalis DOKS13 and Weissella cibaria DOKS11 were able to produce tyramine and also possess the tyrosine decarboxylase (tdc) gene. The effectiveness of nisin Z-producing Lc. lactis KTH0-18 against tyraminogenic strains was evaluated in co-cultivation. In competition study, Ent. faecalis DOKS13 and W. cibaria DOKS11 decreased significantly the growth rate and the maximal cell concentration, depending on the initial inoculum level of tyraminogenic strain. The reduction of tyramine accumulation decreased strongly when tyraminogenic strain was inoculated at 4.0 log CFU/ml and, to a lesser extent, at 5.0 and 6.0 log CFU/ml. Additionally, kung-som inoculation with nisin Z-producing Lc. lactis KTH0-1S as a starter culture could suppress the growth of undesirable bacteria such as Enterobacteriaceae, S. aureus and total viable count (TVC), comparing with spontaneous fermented kung-som (without starter culture). The addition of Lc. lactis KTHO-18 as a starter culture in kung-som reduced accumulation of tyramine about 100 mg/kg in comparison with naturally fermented kung-som. Our result indicated that Lc. lactis KTH0-1S as a starter culture is advisable for production of safer kung-som with decreasing pathogen contaminants and lowering the tyramine content. Furthermore, the obtained result from DGGE profile showed the coagulase-negative staphylococci (CNS) as minor bacterial flora in kung-som. CNS have been used as starter culture in various fermented foods, they play a major role in the development of sensory properties and color development of fermented foods. The safety evaluation and technological characteristics were primary criteria for selection of CNS to be applied as starter culture in kung-som production. Among 46 CNS strains, only strain Staphylococcus carnosus K21S22 was considered as safe to be used with regard to its sensitiveness to antibiotics tested, non-hemolytic and non-biogenic production. Additionally, its strain showed the lipolytic, proteolytic and nitrate reductase activities, as well as its adaptability under high salt content and acidic conditions. Comparison of kung-som production by using single starter culture (S. carnosus K21S22 or Lc. lactis KTH0-1S), mixed starter cultures and spontaneous kung-som, they were significant differences (p<0.05) in pH, titratable acidity. However, the pathogenic bacteria such as B. cereus, C. perfringens, E. coli, S. aureus and Salmonella sp. did not detect in all kung-som treatments. For sensory evaluation, all kung-som treatments (spontaneous, inoculated with only Lc. lactis KTH0-18 or S. carnosus K21S22 and mixed starter cultures) were significant difference (p<0.05) in appearance, taste, texture, flavor and overall acceptance. The panelists gave the higher score for organoleptic of kung-som inoculated with Lc. lactis KTH0-1S and mixed culture than the spontaneous kung-som and inoculated kung-som with S. carnosus K21S22. Regarding to our results obtained, it indicates that nisin Z-producing Lc. lactis KTHO-IS are good promising starter culture to successfully apply in kung- som fermentation. It will further expand the application area of bacteriocin producing LAB or CNS strain as starter culture to fermented products for shorten time periods of fermentation, increasing food safety, extended shelf-life and improving quality of products. กุ้งส้มเป็นอาหารหมักชนิดหนึ่งที่นิยมบริโภคกันอย่างแพร่หลายในภาคใต้ของ ประเทศไทย วัตถุดิบในการผลิตกุ้งส้มคือ กุ้งทะเลขนาดเล็ก (Fenneropenaeus merguiensis) น้ําตาล เกลือ และนํ้า จากนั้นหมักด้วยวิธีธรรมชาติโดยอาศัยแบคทีเรียประจําถิ่นในวัตถุดิบ ส่งผลให้กุ้งส้ม มีกลิ่นและรสชาติที่เป็นเอกลักษณ์ การศึกษาครั้งนี้ทําการตรวจสอบความปลอดภัยทางจุลชีววิทยา ของกุ้งส้มที่จําหน่ายในท้องตลาดและศึกษาความหลากหลายของแบคทีเรียในตัวอย่างกุ้งส้มด้วย เทคนิค polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) พบว่าใน ทุกตัวอย่างของกุ้งส้มตรวจไม่พบเชื้อก่อโรค ได้แก่ Escherichia coli, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus และ Salmonella sp. นอกจากนี้ผลการวิเคราะห์ความหลากหลายของกลุ่ม ประชากรแบคทีเรียในกุ้งส้ม โดยใช้ส่วนของ V3 บนยีน 16S rRNA พบว่าแบคทีเรียแลกติกเป็น กลุ่มประชากรหลักในผลิตภัณฑ์กุ้งส้ม ได้แก่ Lactobacillus farciminis, Lb. plantarum, Lactococcus garvieae, Tetragenococcus halophillus และ Weissella thailandensis นอกจากนี้ผลการจําแนกความ หลากหลายของกลุ่มประชากรแบคทีเรียด้วยเทคนิค DGGE พบว่าแบคทีเรียกลุ่ม coagulase- negative staphylococci (CNS) เป็นแบคทีเรียกลุ่มรองในผลิตภัณฑ์กุ้งส้ม จากผลการศึกษาทําให้ ทราบถึงความหลากหลายของกลุ่มประชากรแบคทีเรียเพื่อพัฒนาเป็นกล้าเชื้อในการผลิตกุ้งส้ม ปัจจุบันมีการใช้แบคเทอริโอซินที่ผลิตโดยแบคทีเรียแลกติกอย่างแพร่หลายเพื่อใช้ เป็นสารชีวภาพที่ออกฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรียแทนที่ยาปฏิชีวนะในอุตสาหกรรมอาหาร แบคทีเรีย แลกติกสายพันธุ์ Lactococcus lactis KTH0-1S ที่แยกได้จากกุ้งส้มสามารถผลิตแบคเทอริโอซินที่ ทนร้อนและมีความสามารถยับยั้งแบคทีเรียที่ก่อโรคในอาหารและแบคทีเรียที่ทําให้อาหารเน่าเสีย การศึกษาคุณสมบัติของแบคเทอริโอซิน พบว่าแบคเทอริโอซินมีความคงตัวที่พีเอช 2-11 และ อุณหภูมิ 80-121°C แต่กิจกรรมการยับยั้งของแบคเทอริโอซินสูญเสียไปเมื่อถูกย่อยด้วยเอนไซม์ กลุ่มโปรติเอส การศึกษากิจกรรมการยับยั้งของ Le. lactis KTH0-1S ต่อแบคทีเรียก่อโรค S. aureus พบว่า Lc. lactis KTH0-1S สามารถยับยั้งการเจริญของ S. aureus อย่างมีนัยสําคัญเมื่อเลี้ยงร่วมกันเป็นเวลา 9 ชั่วโมง นอกจากนี้การเติมแบคเทอริโอซิน KTH0-1S ร่วมกับการเลี้ยงแบคทีเรีย S. aureus พบว่าจํานวนเซลล์ S. aureus ลดลงอย่างรวดเร็ว (2 log CFU/ml) ซึ่งแสดงให้เห็นว่า แบคเทอริโอซินมีกิจกกรมการยับยั้งแบบ bactericidal ภายหลังการทําบริสุทธิ์แบคเทอริโอซิน KTH0-1S ซึ่งประกอบด้วย 4 ขั้นตอน โดยการตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต, reverse phase cartridge (C8 Sep-Pak), โครมาโตกราฟีแบบแลกเปลี่ยนประจุบวก และ RP-HPLC (C8 column) เมื่อนําแบคเทอริโอซินบริสุทธิ์ KTH0-1S ไปวิเคราะห์ด้วยเครื่อง mass spectrometry พบว่าแบคเทอริโอซิน KTH0-15 มีน้ําหนักโมเลกุลเท่ากับ 3.346 กิโลดาลตัน และเมื่อศึกษาหายืน ไนซินด้วยเทคนิค PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่มีความจําเพาะเจาะจงและวิเคราะห์ลําดับนิวคลีโอไทด์ พบว่าแบคเทอริโอซินที่ผลิตโดย Le, lactis KTH0-15 คือ ไนซิน Z (nisin Z) นอกจากนี้การศึกษา ความปลอดภัยของ Lc. lactis KTH0-1S ไม่พบการดื้อต่อยาปฏิชีวนะ ไม่ผลิตสารกลุ่มไบโอจีนิก เอมีน (non-biogenic amines) และไม่พบ virulence factors gene และ ผลการศึกษาสรุปได้ว่า แบคทีเรียแลกติก Lc. lactis KTH0-15 มีศักยภาพในการใช้เป็นกล้าเชื้อเพื่อผลิตกุ้งส้มให้มีความ ปลอดภัยเพิ่มขึ้น การศึกษาการลดปริมาณสารกลุ่มไบโอจีนิกเอมีนในอาหารหมัก พบว่าแบคทีเรีย แลกติกที่ผลิตแบคเทอริโอซินสามารถยับยั้งการเกิดสารกลุ่มไบโอจีนิกเอมีน ได้ ซึ่งไทรามีน (tyramine) เป็นสารในกลุ่มไบโอจีนิกเอมีนที่พบมากในอาหารหมักหลายชนิด มีความเป็นพิษต่อ ร่างกายมนุษย์ ไทรามีนเกิดจากการเปลี่ยนกรดอะมิโนไทโรซีน (tyrosine) โดยกิจกรรมของเอนไซม์ ไทโรซีนดีคาร์บอกซิเลส (tyrosine decarboxylase) ของแบคทีเรียที่พบในอาหารหมัก การศึกษานี้ ได้คัดเลือกแบคทีเรียที่มีความสามารถผลิตไทรามีนด้วยวิธีโครมาโตกราฟีและชีวโมเลกุล จาก แบคทีเรีย 20 ไอโซเลตที่แยกจากกุ้งส้ม พบว่าตรวจพบยีน tyrosine decarboxylase (tdc) และการ ผลิตไทรามีนจากแบคทีเรีย 3 ไอโซเลต คือ Enterococcus faecalis DOKS13, Ent. faecalis 9Y และ Weissella cibaria DOKS11 เมื่อศึกษาผลการยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียที่ผลิตไทรามีนด้วย Lc. lactis KTH0-1S ที่ผลิตไนซิน 2 โดยวิธีเพาะเลี้ยงร่วมกัน พบว่า Lc. lactis KTH0-1S สามารถ ยับยั้งอัตราการเจริญและจํานวนเซลล์สูงสุดของ Ent. faecalis D0KS13 และ W. cibaria D0KS11 อย่างมีนัยสําคัญ ซึ่งผลการยับยั้งขึ้นกับจํานวนเซลล์เริ่มต้นของแบคทีเรียที่ผลิตไทรามีน นอกจากนี้ ปริมาณไทรามีนสะสมจะลดลงอย่างรวดเร็วในชุดการทดลองที่มีจํานวนเซลล์เริ่มต้นของแบคทีเรีย ที่ผลิตไทรามีนเท่ากับ 4.0 log CFU/ml และลดช้าลงเมื่อจํานวนเซลล์เริ่มต้นของแบคทีเรียที่ผลิตไท รามีนเท่ากับ 5.0 และ 6.0 log CFU/ml นอกจากนี้ชุดการทดลองที่เติม Lc. lactis KTH0-1S เป็นกล้า เชื้อในการผลิตกุ้งส้มสามารถยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียทั้งหมด แบคทีเรียกลุ่ม Enterobacteriacea และ S. aureus เมื่อเปรียบเทียบกับชุดควบคุมที่ไม่เติมกล้าเชื้อในการผลิตกุ้งส้มส่วนปริมาณ ไทรามีนในกุ้งส้มที่เดิม Lc. lactis KTH0-1S เป็นกล้าเชื้อสามารถลดไทรามีนลง 100 mg/kg เปรียบเทียบกับกุ้งส้มที่หมักโดยวิธีธรรมชาติ จากผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า Lc. lactis KTH0-1S ไทรามีน เหมาะสมเป็นกล้าเชื้อในการผลิตกุ้งส้มเพื่อลดการปนเปื้อนเชื้อก่อโรคและปริมาณ จากผลการศึกษาความหลากหลายของกลุ่มประชากรแบคทีเรียด้วยวิธี PCR- DGGE พบว่าแบคทีเรียกลุ่ม CNS เป็นกลุ่มประชากรรองในกุ้งส้ม มีการใช้แบคทีเรียกลุ่ม CNS เป็น กล้าเชื้อในอาหารหมักหลากหลายชนิด เนื่องจากแบคทีเรียกลุ่มนี้มีผลต่อสีและคุณภาพด้าน ประสาทสัมผัสของอาหารหมัก การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อคัดเลือกแบคทีเรีย CNS ที่มีความ ปลอดภัยและคุณสมบัติที่ดีเพื่อใช้เป็นกล้าเชื้อในการผลิตกุ้งส้ม จากแบคทีเรียกลุ่ม CNS 46 ไอโซ- เลต ที่แยกจากกุ้งส้ม มีเพียง 1 ไอโซเลต คือ แบคทีเรียสายพันธุ์ Staphylococcus carnosus K21K22 ที่มีความปลอดภัย เนื่องจากไม่พบการดื้อยาปฏิชีวนะ ไม่พบการย่อยเม็ดเลือดแดง และไม่ผลิตสาร กลุ่มไบโอจีนิกเอมีน นอกจากนี้แบคทีเรียสายพันธุ์นี้แสดงกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปส โปรติเอส และไนเตรตรีดักเตส (nitrate reductase) และเจริญในสภาวะที่เป็นกรดและเกลือสูง นอกจากนี้ การศึกษาเปรียบเทียบกุ้งส้มที่ผลิตโดยใช้กล้าเชื้อเดี่ยว Lc. lactis KTH0-1S และ S. carnosus K21S22 หรือกล้าเชื้อผสมระหว่าง Le, lactis KTH0-1S และ S. carnosus K21522 และการผลิตกุ้ง ส้มแบบดั้งเดิม พบความแตกต่างของพีเอชและปริมาณกรดทั้งหมดอย่างมีนัยสําคัญทางสถิติ (p<0.05) อย่างไรก็ตาม ไม่พบจุลินทรีย์ก่อโรค ได้แก่ B. cereus, C. perfringens, E. coli, S. aureus และ Salmonella sp. ในกุ้งส้ม ทั้ง 4 ชุดการทดลอง การศึกษาทางประสาทสัมผัสของกุ้งส้มทั้ง 4 ชุด การทดลอง ได้แก่ ชุดควบคุมที่ไม่เติมกล้าเชื้อ ชุดที่เติมเฉพาะกล้าเชื้อ Lc. lactis KTH0-1S ชุดที่เติม เฉพาะกล้าเชื้อ S. carnosus K21S22 และชุดที่เติมกล้าเชื้อผสมระหว่าง Lc. lactis KTH0-1S และ S. carnosus K21S22 พบว่าผู้ทดสอบชิมให้คะแนนความชอบลักษณะปรากฏ สี รสชาติ กลิ่นรส เนื้อสัมผัสและความชอบรวมของกุ้งส้มทั้ง 4 ชุดการทดลอง มีความแตกต่างอย่างมีนัยสําคัญทาง สถิติ (p<0.05) โดยผู้ทดสอบชิมให้ผลคะแนนความชอบด้านประสาทสัมผัสในกุ้งส้มที่ผลิตโดยใช้ กล้าเชื้อ Ie. lactis KTH0-1S และกล้าเชื้อผสมระหว่าง Ic, lactis KTH0-1S และ S. carnosus K21S22 มากกว่ากุ้งส้มที่ผลิตแบบดั้งเดิมและกุ้งส้มที่เติมเฉพาะกล้าเชื้อ S. carnosus K21522 จากการศึกษาทั้งหมดสามารถสรุปได้ว่าแบคทีเรียสายพันธุ์ Lc. lactis KTH0-1S เป็นกล้าเชื้อที่ดีในการผลิตกุ้งส้ม อีกทั้งการศึกษานี้ยังสามารถขยายองค์ความรู้เกี่ยวกับการ ประยุกต์ใช้แบคทีเรียแลกติกที่ผลิตแบคเทอริโอซินหรือแบคทีเรียกลุ่ม CNS เพื่อเป็นกล้าเชื้อใน ผลิตภัณฑ์อาหารหมักต่าง ๆ เพื่อลดระยะเวลาการหมัก เพิ่มความปลอดภัย ยืดอายุการเก็บรักษา และปรับปรุงคุณภาพของผลิตภัณฑ์ 2019-05-30T08:35:35Z 2019-05-30T08:35:35Z 2018 Thesis http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/12261 en_US Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Thailand http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/th/ application/pdf |