Identification of bacteria harboring transglutaminase gene and its cloning and expression in Escherichia coli
Doctor of Philosophy (Biotechnology), 2018
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | Theses and Dissertations |
| Language: | English |
| Published: |
Prince of Songkla University
2023
|
| Subjects: | |
| Online Access: | http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/19021 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Institution: | Prince of Songkhla University |
| Language: | English |
| id |
th-psu.2016-19021 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| institution |
Prince of Songkhla University |
| building |
Khunying Long Athakravi Sunthorn Learning Resources Center |
| continent |
Asia |
| country |
Thailand Thailand |
| content_provider |
Khunying Long Athakravi Sunthorn Learning Resources Center |
| collection |
PSU Knowledge Bank |
| language |
English |
| topic |
Gram-negative bacteria Classification |
| spellingShingle |
Gram-negative bacteria Classification Suwannee Khunthongpan Identification of bacteria harboring transglutaminase gene and its cloning and expression in Escherichia coli |
| description |
Doctor of Philosophy (Biotechnology), 2018 |
| author2 |
Punnanee Sumpavapol |
| author_facet |
Punnanee Sumpavapol Suwannee Khunthongpan |
| format |
Theses and Dissertations |
| author |
Suwannee Khunthongpan |
| author_sort |
Suwannee Khunthongpan |
| title |
Identification of bacteria harboring transglutaminase gene and its cloning and expression in Escherichia coli |
| title_short |
Identification of bacteria harboring transglutaminase gene and its cloning and expression in Escherichia coli |
| title_full |
Identification of bacteria harboring transglutaminase gene and its cloning and expression in Escherichia coli |
| title_fullStr |
Identification of bacteria harboring transglutaminase gene and its cloning and expression in Escherichia coli |
| title_full_unstemmed |
Identification of bacteria harboring transglutaminase gene and its cloning and expression in Escherichia coli |
| title_sort |
identification of bacteria harboring transglutaminase gene and its cloning and expression in escherichia coli |
| publisher |
Prince of Songkla University |
| publishDate |
2023 |
| url |
http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/19021 |
| _version_ |
1783957337566871552 |
| spelling |
th-psu.2016-190212023-11-07T03:48:41Z Identification of bacteria harboring transglutaminase gene and its cloning and expression in Escherichia coli การจำแนกแบคทีเรียที่มียีนทรานส์กลูตามิเนส การโคลนและการแสดงออกของยีนใน Escherichia coli Suwannee Khunthongpan Punnanee Sumpavapol Faculty of Agro-Industry (Industrial Biotechnology) คณะอุตสาหกรรมเกษตร ภาควิชาเทคโนโลยีชีวภาพอุตสาหกรรม Gram-negative bacteria Classification Doctor of Philosophy (Biotechnology), 2018 The bacterial strain C1112T was isolated from seafood processing wastewater collected from a treatment pond of the seafood factory in Songkhla Province, Thailand. It was Gram-negative, rod shape, non-spore former and produced transglutaminase (TGase). Phylogenetic analysis based on concatenated sequences from the 16S rRNA gene and five housekeeping genes, fusA, lepA, leuS, gyrB and ileS, respectively showed that the strain C1112T belonged to the genus Providencia, and shared 91.75% similarity with P. stuartii DSM 4539T. DNA-DNA hybridization between the strain C1112T and P. stuartii KCTC 2568T was 48.1% relatedness. Moreover, some results from biochemical properties indicated that the strain C1112T was distinguished from the phylogenetically closest relatives. The major fatty acids of strain C1112T were C16:0, iso-C15:0, C14:0 and C17:0 cyclo and the DNA G+C content was 41 mol%. Base on the genotypic and phenotypic considerations, it was classified as a novel species of the genus Providencia for which the name Providencia thailandensis sp. nov. was proposed. The type strain is C1112T (= KCTC 23281T =NBRC 106720T). A novel strain of Enterobacter, C2361T, a Gram-negative, non-spore-forming rod-shaped and facultative anaerobic bacterium with capability to produce the TGase, was isolated from seafood processing wastewater collected from a treatment pond of the seafood factory in Songkhla Province, Thailand. Phylogenetic analysis and phenotypic characteristics, including chemotaxonomic characteristics, showed that the strain was a member of the genus Enterobacter. The 16S rRNA gene sequence similarities between the strain C2361T and Enterobacter cloacae subsp. cloacae ATCC 13047T and Enterobacter cloacae subsp. dissolvens LMG 2683T were 97.5 and 97.5%, respectively. The major fatty acids were C16:0, C17:0cyclo and C14:0. The DNA G+C content was 53.0 mol%. On the basis of the polyphasic evidences gathered in this study, it was classified as a novel species of the genus Enterobacter for which the name Enterobacter siamensis sp. nov. was proposed. The type strain is C2361T (= KCTC 23282T = NBRC 107138T). TGase genes of P. thailandensis and E. siamensis were amplified by specific and degenerate primers using 2 Taq Master Mix (Vivantis) and Takara Ex Taq as DNA polymerase in PCR reactions. 1,100-bp and 1,200-bp were amplified products from E. siamensis genomic DNA, using F1R1 and F2R1 primer with 2 Taq Master. In addition, 1100-bp amplified product from P. thailandensis genomic DNA was obtained by using tgFtgR2 primer with Takara Ex Taq DNA polymerase and ligated with pSSBm97 and expressed into B. megaterium YYBm1. However, TGase activity could not detect from the expressed proteins. Due to P. thailandensis and E. siamensis are novel species, therefore no information regarding their TGase genes could be acquired from the database. This makes it quite difficult to design primers for TGase gene amplification from these two bacteria. Previously, TGase was produced by the genus Streptomyces isolated from soil. In this study, Streptomyces-like strains were isolated from soil and identified using 16S rRNA gene. The stain AH6 showed 99 % similarity with that of Streptomyces thermocarboxydus and named as Streptomyces sp. AH6. The TGase gene of Streptomyces sp. AH6 was constructed by fusion of TGase precursor and pET22b plasmid. The recombinant DNAs were transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). The TGase ORF of this gene encoding 410 amino acids. Although the amino acid sequence of theTGase precursor was 100% homologous to that of S. mobaraensis NBRC 13476, the nucleotide sequence was different at 6 nucleotide proteins, including the nucleotide 231, 234, 237, 240, 246 and 249. The pET22b-TG-His6 was secreted as a soluble inclusion body in E. coli and the activity of partially purified enzyme was 3.2 U/ml. The optimal pH and temperature of this enzyme was 6.0 and 40˚C, respectively. The enzyme was inhibited by Cu2+ and Fe2. แบคทีเรียสายพันธุ์ C1112Tแยกได้จากน้าเสียในบ่อบาบัดของโรงงานอาหารทะเลในจังหวัดสงขลา ประเทศไทย เป็นแบคทีเรียแกรมลบ รูปแท่ง ไม่สร้างสปอร์และผลิตเอนไซม์ทรานส์กลูตามิเนส ผลการวิเคราะห์ลาดับวิวัฒนาการของ 16S rRNA gene และ ยีนทีมีการแสดงออกอย่างสม่าเสมอ (housekeeping genes) จานวน 5 ยีน ได้แก่ fusA, lepA, leuS, gyrB และ ileS ซึ่งเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ Elongation factor G, GTP binding elongation factor, Leucyl-tRNA synthase, DNA gyrase, B subunit และ Isoleucyl-tRNA synthase ตามลาดับ พบว่าแบคทีเรียสายพันธุ์ C1112T มีความเหมือนกับแบคทีเรียในสกุล Providencia โดยมีความเหมือนกับ P. stuartii DSM 4539T 91.75% และเมื่อทาดีเอ็นเอ-ดีเอ็นเอไฮบริไดเซชั่นกับเชื้อ P. stuartii KCTC 2568T พบว่ามีความสัมพันธ์กัน 48.1% แต่คุณสมบัติทางชีวเคมีบางอย่างมีความแตกต่างจากเชื้อแบคทีเรียทีที่มีสายวิวัฒนาการใกล้เคียงกัน นอกจากนี้แบคทีเรียสายพันธุ์ C1112T มีกรดไขมันที่สาคัญคือ C16:0, iso-C15:0, C14:0 และ C17:0 cyclo โดยมี G+C content เท่ากับ 41 mol% การศึกษาลักษณะทางจีโนไทป์และฟีโนไทป์แสดงให้เห็นว่าแบคทีเรียสายพันธุ์ C1112T เป็นแบคทีเรียสายพันธุ์ใหม่ในสกุล Providencia โดยให้ชื่อว่า Providencia thailandensis และมี type strain คือ C1112T (= KCTC 23281T =NBRC 106720T) แบคทีเรียสายพันธุ์ใหม่ C2361T เป็นแบคทีเรียแกรมลบ รูปแท่ง ไม่สร้างสปอร์ เจริญได้ทั้งที่มีและไม่มีอากาศ และผลิตเอนไซม์ทรานส์กลูตามิเนส ซึ่งคัดแยกได้จากน้าเสียในบ่อบาบัดของโรงงานอาหารทะเลในจังหวัดสงขลา ประเทศไทย ผลการวิเคราะห์ลาดับวิวัฒนาการ ลักษณะทางฟีโนไทป์ รวมทั้งสมบัติทางเคมีแสดงให้เห็นว่าเป็นแบคทีเรียในสกุล Enterobacter โดยลาดับเบสบน 16S rRNA gene มีความคล้ายกับ Enterobacter cloacae subsp. cloacae ATCC 13047T และ Enterobacter cloacae subsp. dissolvens LMG 2683T ที่ 97.5 และ 97.5% ตามลาดับ กรดไขมันที่สาคัญ ได้แก่ C16:0, C17:0cyclo และ C14:0 โดยมี G+C content เท่ากับ 53.0 mol% การศึกษาลักษณะทางฟีโนไทป์ จีโนไทป์ และทางเคมีแสดงให้เห็นว่าแบคทีเรียสายพันธุ์ C2361T เป็นแบคทีเรียสายพันธุ์ใหม่ในสกุล Enterobacter โดยให้ชื่อว่า Enterobacter siamensis และมี type strain คือ C2361T (= KCTC 23282T = NBRC 107138T) การแอมพลิไฟล์ยีนทรานส์กลูตามิเนสจากเชื้อ P. thailandensis และ E. siamensis โดยใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบแบบ specific และ degenerate ในการแอมพลิไฟล์ยีนโดยใช้ดีเอ็นเอ พอลิเมอเรส สองชนิด คือ 2 Taq Master Mix (Vivantis) และ Takara Ex Taq พบว่าการแอมพลิไฟล์ยีนจากเชื้อ E. siamensis โดยใช้ไพรเมอร์ F1R1 และ F2R1 ด้วยดีเอ็นเอพอลิเมอเรส 2 Taq Master Mix ได้แถบดีเอ็นเอขนาด 1,100 bp และ 1,200 bp ตามลาดับ นอกจากนี้เชื้อ P. thailandensis ที่ทาการแอมพลิไฟล์ยีนโดยใช้ไพรเมอร์ tgFtgR2 ด้วยดีเอ็นเอพอลิเมอเรส Takara Ex Taq พบว่ามีแถบดีเอ็นเอขนาด 1,100 bp จากนั้นได้ทาการเชื่อมต่อดีเอ็นกับพลาสมิด pSSBm97และศึกษาการแสดงออกของโปรตีนใน Bacillus megaterium YYBm1 อย่างไรก็ตามพบว่าไม่สามารถตรวจวัดกิจกรรมของเอนไซม์ทรานส์กลูตามิเนสได้ เนื่องจากเชื้อ P. thailandensis และ E. siamensis เป็นเชื้อใหม่ซึ่งยังไม่มีข้อมูลของยีนในฐานข้อมูล จึงทาให้ค่อนข้างยากที่จะออกแบบไพรเมอร์เพื่อแอมพลิไฟล์ยีนจากเชื้อทั้งสองชนิด เชื้อในสกุล Streptomyces ซึ่งพบได้มากในดินสามารถผลิตเอนไซม์ทรานส์กลูตามิเนสได้ จากการคัดแยกเชื้อจากดินพบเชื้อ AH6 มีลักษณะเหมือนเชื้อกลุ่ม Streptomyces จึงทาการจาแนกเชื้อโดยใช้ 16S rRNA gene พบว่าลาดับเบสของ 16S rRNA มีความเหมือนกับเชื้อ Streptomyces thermocarboxydus 99% โดยให้ชื่อเชื้อ AH6 ว่า Streptomyces sp. AH6 จากนั้นทาการโคลนยีนทรานส์กลูตามิเนสจากเชื้อ Streptomyces sp. AH6โดยการเชื่อม TGase precursor กับ พลาสมิด pET22b แล้วถ่ายโอนดีเอ็นเอลูกผสมไปยัง Escherichia coli BL21 (DE3) ผลการอ่านรหัสของดีเอ็นเอลูกผสมนี้พบว่าสามารถแปลงรหัสเป็นกรดอะมิโนได้จานวน 410 อะมิโน โดยลาดับกรดอะมิโนของเอนไซม์ทรานส์กลูตามิเนสของเชื้อ Streptomyces sp. AH6 เหมือนกับลาดับกรดอะมิโนของเชื้อ S. mobaraensis NBRC 13476 100% แต่ผลของลาดับนิวคลีโอไทด์มีความต่างกัน 6 นิวคลีโอไทด์ ซึ่งได้แก่ นิวคลีโอไทด์ที่ตาแหน่ง 231, 234, 237, 240, 246 และ 249 โดยดีเอ็นเอลูกผสมที่ได้จากการเชื่อมต่อยีนเรียกว่า pET22b-TG-His6 และมีการแสดงออกของเอนไซม์ ทรานส์กลูตามิเนสแบบสารละลาย อยู่ภายในเซลล์ของ E. coli จากนั้นทาบริสุทธิ์เอนไซม์ที่ได้ พบว่ามีกิจกรรมของเอนไซม์เท่ากับ 3.2 U/ml เอนไซม์สามารถทางานได้ดีที่ pH และอุณหภูมิเท่ากับ 6.0 และ 40 องศาเซลเซียส ตามลาดับ และถูกยับยั้งการทางานด้วย Cu2+ และ Fe2+ 2023-11-07T03:48:41Z 2023-11-07T03:48:41Z 2018 Thesis http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/19021 en Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Thailand http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/th/ application/pdf Prince of Songkla University |